[發明專利]一種利用重組微生物全細胞催化合成L-苯乳酸的方法

在審

• 申請號: 202110253638.6
• 申請日: 2021-03-02
• 公開（公告）號: CN113025544A
• 公開（公告）日: 2021-06-25
• 發明（設計）人: 饒志明;邵宇;張顯;徐美娟;楊套偉;邵明龍
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12P7/42;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 林娟

本發明公開了一種利用重組微生物全細胞催化合成L?苯乳酸的方法，屬于酶工程和基因工程技術領域。本發明提出了一種有效的多酶串聯重組大腸桿菌全細胞催化苯丙氨酸合成L?苯乳酸的轉化體系，首次將L?氨基酸脫氨酶和苯丙酮酸還原酶用于催化苯丙氨酸合成L?苯乳酸，成功實現了L?氨基酸脫氨酶，苯丙酮酸還原酶和葡萄糖脫氫酶共表達菌株的構建。最終產量達到21.39g/L，摩爾轉化率為71.33％。采用全細胞催化合成苯乳酸，操作工藝便捷，轉化效率優于以往L?苯乳酸的生物合成方法，為L?苯乳酸工業化生產及應用奠定了理論和實踐基礎，具有一定指導意義。

技術領域

本發明涉及一種利用重組微生物全細胞催化合成L-苯乳酸的方法，屬于酶工程和基因工程技術領域。

背景技術

苯乳酸(phenyllactic acid，PLA)，即2-羥基-3-苯基丙酸，是一種小分子天然有機酸，廣泛存在于干酪、天然蜂蜜中。作為一種天然抑菌物質，對多種病原性微生物都具有光譜抑制作用，但對人和動物細胞均無毒性。其溶解性良好，可均勻溶解于水性溶劑中。此外，苯乳酸具有耐酸、耐堿、耐高溫等特性，并能有效的抑制食腐性微生物的生長，在食品工業中具有廣闊的應用前景。

L-苯乳酸作為苯乳酸兩種對映異構體中的一種，是合成許多藥物制劑的前體，此外，作為一種重要化工合成的原材料，可以用于合成非蛋白氨基酸、抗HIV試劑和降血糖劑等。

目前國內外合成L-苯乳酸主要是化學合成法、微生物發酵和生物催化合成。化學合成法技術路線復雜，反應條件苛刻，使用大量有機溶劑易于產生環境污染，副產物多，后續分離困難，不易純化。微生物發酵法主要指利用篩選或改造的具有特殊性能的菌體，在合適的發酵條件下，通過微生物分解代謝與合成代謝生產出苯乳酸。目前報道以苯丙酮酸為底物合成苯乳酸的文獻較多，關于苯丙氨酸一步合成苯乳酸的報道較少，且苯丙酮酸價格偏高，挖掘能夠成本低廉并高效轉化的生物催化合成苯乳酸方法是未來研究亟待解決的問題。

目前，以苯丙氨酸為底物轉化合成苯乳酸，并實現輔因子NAD⁺和NADH的循環，至少需要三個酶的參與，比如用氨基酸脫氨酶和乳酸脫氫酶轉化苯丙氨酸合成苯乳酸，還需在體系中添加葡萄糖脫氫酶，再在乳酸脫氫酶和葡萄糖脫氫酶的作用下實現輔因子NAD⁺和NADH的循環，但是，此種方法的成本過高。

全細胞轉化相比分離酶具有如下優勢：全細胞生物催化劑更容易制備，成本低；比分離酶更穩定，不易受環境溫度、pH等因素影響，使用方便；轉化過程中不產生有毒害產品，不產生其他副產物。有望實現低能耗、高效率、高純度、無污染的工業化苯乳酸生產。

因此，提供構建一種操作簡便、成本低、轉化率高、適合工業化生產的多酶級聯催化反應體系，實現苯丙氨酸到L-苯乳酸的一步反應，對于工業上制備L-苯乳酸有重要的應用價值。

發明內容

技術問題：

本發明要解決的技術問題是：提供一種能夠轉化苯丙氨酸生成L-苯乳酸的基因工程菌，并且構建一種操作簡便、成本低、轉化率高、適合工業化生產的多酶級聯催化反應體系，實現苯丙氨酸到L-苯乳酸的一步反應，以解決工業化苯乳酸生產高成本、底得率、污染嚴重的問題。

技術方案：

為了解決上述技術問題，本發明提供了一種以苯丙氨酸為底物生產L-苯乳酸的基因工程菌，該基因工程菌共表達L-氨基酸脫氨酶、苯丙酮酸還原酶和葡萄糖脫氫酶。

在本發明的一種實施方式中，以細菌或真菌為宿主細胞。

在本發明的一種實施方式中，以pET-28a為表達載體。

在本發明的一種實施方式中，所述L-氨基酸脫氨酶來源于普通變形桿菌Proteusvulgaris。

在本發明的一種實施方式中，所述苯丙酮酸還原酶來源于乳酸桿菌Lactobacillus sp.CGMCC 9967。