[發(fā)明專(zhuān)利]對(duì)蝦白斑綜合癥病毒LAMP檢測(cè)簡(jiǎn)并引物組、試劑盒及方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110252535.8
• 申請(qǐng)日: 2021-03-07
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112853004A
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-05-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 董鋮;梁美賢;陳天藍(lán);羅達(dá)圣;唐翔
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 珠海市迪奇孚瑞生物科技有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/70
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 廣東朗乾律師事務(wù)所 44291
• 代理人: 楊煥軍

本發(fā)明公開(kāi)了一種對(duì)蝦白斑綜合癥病毒LAMP檢測(cè)簡(jiǎn)并引物組、試劑盒及方法，所述簡(jiǎn)并引物組包括引物OF、OR、IF、IR、LB，其中，OF：5’?CTTCAGACCATATKTAAGAGTG?3’；OR：5’?GCAGATTCCAAACCAGGAA?3’：IF：5’?GAGCGGGCATAGAAGTGTAAAAMAT?TCTCTTCTTGGAATGATGAACG?3’；IR：5’?TCCAATATGAAGCAATGGGAGCTA?GGTTTAAGCCATGGTCTCT?3’；LB：5’?GTGCTAATGGCAGCTGAA?3’；本發(fā)明通過(guò)設(shè)計(jì)該對(duì)蝦白斑綜合癥病毒LAMP檢測(cè)簡(jiǎn)并引物組完成對(duì)蝦白斑綜合癥病毒的特異性擴(kuò)增，特異性好、靈敏度高，并在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)對(duì)蝦白斑綜合癥病毒的LAMP檢測(cè)試劑盒，所述LAMP檢測(cè)試劑盒可在40分鐘內(nèi)完成多種對(duì)蝦白斑綜合癥病毒株的檢測(cè)，檢測(cè)速度快，操作簡(jiǎn)便，能夠廣泛應(yīng)用于蝦白斑綜合征病毒多種病毒株的快速鑒別診斷。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物病毒檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種對(duì)蝦白斑綜合癥病毒LAMP檢測(cè)簡(jiǎn)并引物組、試劑盒及方法。

背景技術(shù)

對(duì)蝦白斑綜合癥病毒(WSSV)是一種可廣泛感染蝦蟹等十足類(lèi)甲殼動(dòng)物苗種、成體、親體的大型桿狀病毒，自1993年在養(yǎng)殖對(duì)蝦中暴發(fā)以來(lái)，在世界范圍內(nèi)廣泛傳播，導(dǎo)致養(yǎng)殖對(duì)蝦大量死亡，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，快速、準(zhǔn)確、靈敏地檢測(cè)WSSV，加強(qiáng)苗種和成蝦檢疫以及養(yǎng)殖水體環(huán)境的監(jiān)測(cè)，對(duì)預(yù)防病毒感染，切斷病毒傳播，保障我國(guó)對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

目前，對(duì)蝦白斑綜合癥病毒(WSSV)的檢測(cè)方法主要有六種：(1)電鏡觀察法(2)TE染色法(3)病理切片法(4)抗體檢測(cè)法(5)核酸探針雜交法(5)PCR檢測(cè)法。其中，電鏡觀察法雖然可以直接觀察到病毒粒子的存在，但其操作復(fù)雜、耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)、準(zhǔn)確性低；TE染色法和病理切片法都是基于病理學(xué)技術(shù)，不能直接對(duì)病毒進(jìn)行檢測(cè)，只能利用發(fā)病的組織病理征兆進(jìn)行檢測(cè)；抗體檢測(cè)法和核酸探針雜交法是對(duì)病毒本身的蛋白質(zhì)或核酸成分進(jìn)行檢測(cè)，其檢測(cè)靈敏度較低，而且只能針對(duì)發(fā)病或即將發(fā)病的對(duì)蝦進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)蝦白斑綜合癥病毒(WSSV)尚未感染對(duì)蝦或在感染的極早期很難用這兩種方法檢測(cè)出來(lái)；PCR檢測(cè)法憑借靈敏、特異、快速等優(yōu)點(diǎn)，被普遍應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖病原的檢測(cè)中，但PCR技術(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)環(huán)境和操作要求苛刻，產(chǎn)物容易污染；熒光PCR檢測(cè)技術(shù)雖然簡(jiǎn)化了操作步驟，而且可消除擴(kuò)增產(chǎn)物引起的交叉污染，減少假陽(yáng)性的發(fā)生，但實(shí)時(shí)熒光PCR成本較高，目前在水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的常規(guī)病原體檢測(cè)中的應(yīng)用還不多。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是NOTOMI等建立的一種新型的核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，該技術(shù)針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4條特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在恒溫條件下即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增出LAMP特征性梯狀條帶，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)在保持PCR技術(shù)優(yōu)點(diǎn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步增強(qiáng)了反應(yīng)的特異性和縮短了檢測(cè)時(shí)間；特別是它不需使用昂貴的熱循環(huán)儀，在60～65℃的恒溫條件下，歷時(shí)30～60min，即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)反應(yīng)中可形成明顯的白色焦磷酸鎂沉淀，通過(guò)對(duì)濁度的觀察或加入熒光染料，直接通過(guò)顏色變化即可判定反應(yīng)結(jié)果。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)具有高特異性、高效性、快速、簡(jiǎn)便、易檢測(cè)等特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于細(xì)菌、病毒、寄生蟲(chóng)等病原體的檢測(cè)研究，并取得了較理想的效果。

目前，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)應(yīng)用于對(duì)蝦白斑綜合癥病毒檢測(cè)時(shí)通常只能針對(duì)一種對(duì)蝦白斑綜合癥病毒株進(jìn)行檢測(cè)，而目前GenBank公布有4種不同的對(duì)蝦白斑綜合癥病毒株的基因序列(即中國(guó)臺(tái)灣株(TW，AF440570)、泰國(guó)株(TH，AF369029)、中國(guó)株(CN，AF332093)和韓國(guó)株(KR，JX515788))。現(xiàn)有的對(duì)蝦白斑綜合癥病毒LAMP檢測(cè)引物、試劑盒和檢測(cè)方法無(wú)法完成多種對(duì)蝦白斑綜合癥病毒株的檢測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的旨在提供一種對(duì)蝦白斑綜合癥病毒LAMP檢測(cè)簡(jiǎn)并引物組。