[發明專利]Arvcf基因敲除動物模型的構建方法及應用

有效

• 申請號: 202110251519.7
• 申請日: 2021-03-08
• 公開（公告）號: CN112980881B
• 公開（公告）日: 2022-07-19
• 發明（設計）人: 李明定;陳佳麗;韓海軍
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/12;A01K67/027
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 應孔月

本發明涉及一種建立Arvcf基因敲除小鼠模型的方法及應用，所述小鼠模型是敲除了Arvcf基因中的七個外顯子的小鼠，同時揭示了一種建立Arvcf基因敲除小鼠模型的方法。首先確定待敲除基因Arvcf的敲除區域，然后設計特異性的sgRNA和對應的引物并合成，再將構建好的sgRNA/Cas9載體線性化并純化后進行體外轉錄，最后通過顯微注射一起注射入小鼠的受精卵中，并將其移植到假孕母鼠子宮進行Arvcf基因敲除小鼠模型的建立。收集所獲得的子代小鼠的尾巴并抽提DNA，使用兩對引物通過兩次PCR反應以及測序以確認所獲得的小鼠為野生型或敲除Arvcf基因目的區域的純合或雜合型小鼠。該基因敲除小鼠模型可用于研究ARVCF在所參與的精神類疾病中的作用。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，尤其涉及一種Arvcf基因敲除動物模型的構建方法及應用。

背景技術

ARVCF(Armadillo Repeat gene deleted in Velo-Cardio-Facial syndrome)基因所編碼的蛋白是p120ctn連環蛋白家族的成員，其它成員還包括p120ctn，δ-catenin和p0071等。該蛋白家族在粘著連接復合物形成中起關鍵作用，在神經形態發生的各方面也都有重要的作用，并且該家族的成員也被發現與多種神經發育疾病相關。另外，ARVCF蛋白是鈣粘蛋白-連環蛋白復合物的一部分，可能在各種細胞類型中調節鈣粘蛋白介導的連接結構和細胞間粘附，ARVCF基因還被報道參與來自神經節隆起的神經元的遷移。此外，在精神類疾病的遺傳學研究中，ARVCF基因還被發現與精神分裂癥、吸煙成癮等相關。

轉錄激活樣效應因子核酸酶(Transcription activator-like effectornuclease，TALEN)技術與鋅指核酸酶(Zinc-finger nuclease，ZFN)是兩種常見的基因組編輯工具，其可通過誘導DNA雙鏈斷裂，然后刺激非同源末端連接(Non-homologous endjoining，NHEJ)對斷裂的DNA雙鏈進行修復或在基因的特定位置通過同源重組修復(Homology-directed repair，HDR)，由此可實現對靶基因的敲除。然而，這兩種基因編輯技術存在許多不足之處，比如操作繁瑣費時、對細胞的毒性大、成本高昂等。

發明內容

本發明實施例的目的是提供一種基于新一代基因編輯技術建立Arvcf基因敲除小鼠模型的方法及應用，以解決現有基因編輯技術操作繁瑣、成本高昂等技術問題，同時也可解決缺乏用于研究ARVCF生物學功能動物模型的問題。

根據本發明實施例的第一方面，提供一種Arvcf基因敲除動物模型的構建方法，包括：

根據小鼠Arvcf基因結構的信息，確定待敲除的區域為外顯子4-10，在敲除區域的上游和下游分別設計兩條sgRNA和對應的引物，所述的敲除區域上游的sgRNA和反向引物的序列分別為SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，所述的敲除區域下游的sgRNA和反向引物的序列分別為SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；

使用所述的sgRNA和引物，通過線性化載體、寡核苷酸鏈的退火、連接、重組質粒的轉化，構建sgRNA/Cas9表達載體；

將所述的sgRNA/Cas9表達載體線性化并純化后，作為模板進行體外轉錄，合成sgRNA和Cas9 mRNA；

將合成的sgRNA和Cas9 mRNA一同注射進入小鼠的受精卵中，再將注射后存活的受精卵移植到假孕母鼠的子宮中，出生的F0代小鼠包含Arvcf基因敲除的雜合子小鼠，然后通過PCR反應和測序鑒定為陽性雜合子小鼠時，該小鼠即可穩定遺傳；

取被鑒定為陽性雜合子小鼠進行雜交繁育，獲得Arvcf敲除的純合子個體和野生型個體。

進一步地，使用在線的CRISPR Design工具在敲除區域的上游和下游分別設計sgRNA和對應的引物。