[發明專利]Arvcf基因敲除動物模型的構建方法及應用

有效

• 申請號: 202110251519.7
• 申請日: 2021-03-08
• 公開（公告）號: CN112980881B
• 公開（公告）日: 2022-07-19
• 發明（設計）人: 李明定;陳佳麗;韓海軍
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/12;A01K67/027
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 應孔月

1.一種Arvcf基因敲除動物模型的構建方法，其特征在于，包括：

根據小鼠Arvcf基因結構的信息，確定待敲除的區域為外顯子4-10，在敲除區域的上游和下游分別設計兩條sgRNA和對應的引物，所述的敲除區域上游的sgRNA和反向引物的序列分別為SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，所述的敲除區域下游的sgRNA和反向引物的序列分別為SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；

使用所述的sgRNA和引物，通過線性化載體、寡核苷酸鏈的退火、連接、重組質粒的轉化，構建sgRNA/Cas9表達載體；

將所述的sgRNA/Cas9表達載體線性化并純化后，作為模板進行體外轉錄，合成sgRNA和Cas9 mRNA；

將合成的sgRNA和Cas9 mRNA一同注射進入小鼠的受精卵中，再將注射后存活的受精卵移植到假孕母鼠的子宮中，出生的F0代小鼠包含Arvcf基因敲除的雜合子小鼠，然后通過PCR反應和測序鑒定為陽性雜合子小鼠時，該小鼠即可穩定遺傳；

取被鑒定為陽性雜合子小鼠進行雜交繁育，獲得Arvcf敲除的純合子個體和野生型個體。

2.根據權利要求1所述的一種Arvcf基因敲除動物模型的構建方法，其特征在于，使用在線的CRISPR Design工具在敲除區域的上游和下游分別設計sgRNA和對應的引物。

3.根據權利要求1所述的一種Arvcf基因敲除動物模型的構建方法，其特征在于，所述的PCR反應中的兩對引物為SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6，以及SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8。

4.根據權利要求3所述的一種Arvcf基因敲除動物模型的構建方法，其特征在于，使用SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6這一對引物以及SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8另一對引物分別進行PCR反應，通過PCR產物條帶在凝膠電泳中的大小及有無判斷所獲得小鼠基因型為野生型、雜合子或者純合子，并且所獲得的Arvcf敲除小鼠的第4-10個外顯子被完全敲除，堿基有3bp和5805bp的缺失。

5.根據權利要求1-4任一所述的一種Arvcf基因敲除動物模型的構建方法，其特征在于，所述的動物模型構建方法是基于CRISPR/Cas9技術進行小鼠Arvcf基因敲除的。

6.根據權利要求5所述的構建方法構建的Arvcf基因敲除動物模型的應用，其特征在于，作為研究ARVCF在所參與的精神類疾病中的作用的動物模型。