[發明專利]一種L-高絲氨酸生產菌株及其構建方法和應用

在審

• 申請號: 202110251258.9
• 申請日: 2017-02-27
• 公開（公告）號: CN113151127A
• 公開（公告）日: 2021-07-23
• 發明（設計）人: 謝新開;徐偉;劉婷
• 申請（專利權）人: 四川利爾生物科技有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12P13/06;C12R1/19
• 代理公司: 北京永新同創知識產權代理有限公司 11376
• 代理人: 欒星明;王子楠

本發明的L?高絲氨酸生產菌株中的一個或多個與L?高絲氨酸代謝途徑相關的基因被敲除或弱化，并且/或者一個或多個與L?高絲氨酸代謝途徑相關的基因被過表達或增強，并且/或者一個或多個與L?高絲氨酸代謝途徑相關的基因被突變。本發明還提供了該生產菌株的構建方法以及其應用。本發明的L?高絲氨酸生產菌株，具有產量高、成本低、條件溫和、環境污染少等諸多優點，具有廣闊的應用前景。

本申請為申請日為2017年2月27日、申請號為201710106474.8、發明名稱為“一種L-高絲氨酸生產菌株及其構建方法和應用”的發明專利申請的分案申請。

技術領域

本發明屬于基因工程領域，具體涉及一種L-高絲氨酸生產菌株及其構建方法和應用。

背景技術

L-高絲氨酸是一種天然存在的非蛋白氨基酸，作為生物合成蘇氨酸、蛋氨酸和賴氨酸共有的中間體而少量存在于很多物種中。由于L-高絲氨酸具有L-型-α氨基酸基本骨架，并且其γ-羥基具有多樣的化學活性，因此，L-高絲氨酸及其衍生物作為醫藥中間體在藥物學、生理學等方面有重要應用前景。

目前，國內外生產L-高絲氨酸主要有以下幾種方法：

(1)化學法；該方法合成L-高絲氨酸主要是采用相對昂貴的L-蛋氨酸為原料，并使用具有嚴重生物毒性的碘甲烷或溴甲烷作為甲基化試劑，經親核進攻以保護氨基，再在弱堿性條件下水解得到產物。該方法不僅成本高，并且需要使用碘化物、生成硫化物，對環境不友好；

(2)化學手性拆分方法；該方法是利用混旋的高絲氨酸與手性試劑反應后，會形成非對應異構體的性質差異，由此分離出L-高絲氨酸。該方法產率低，試劑成本高且需使用大量有機溶劑，對環境有較大污染威脅。

(3)生物法；目前主要見報導的是生物酶法，其工藝是利用丙酮酸和甲醛在縮醛酶和L-氨基酸脫氫酶的共同作用下生成氨基酸高絲氨酸。該工藝主要問題仍然是成本高，需要使用有毒原料甲醛和甲酸，并需使用價格昂貴的輔酶等。

微生物發酵法具有成本低、條件溫和、環境污染少等諸多優點，近年來已經成為生產各類氨基酸的首選工藝。但是，由于高絲氨酸對于細菌生長具有較強的抑制作用(可能是源于其對谷氨酸脫氫酶活性抑制作用，J Bacteriol.1973Nov；116(2):663-72),對L-高絲氨酸的直接發酵生產具有挑戰性。因此，目前尚未探索出合適的通過發酵獲得L-高絲氨酸的方法。

發明內容

本發明所要解決的第一個技術問題是提供一種L-高絲氨酸生產菌株。

本發明要解決的第二個技術問題是提供一種構建L-高絲氨酸生產菌株的方法。

本發明要解決的第三個技術問題是現有技術中的生產L-高絲氨酸的方法存在生產成本高、污染大、產率低的問題，進而提供一種可實現低成本、高產量、條件溫和、環境污染少的生產L-高絲氨酸的方法。

本發明的L-高絲氨酸生產菌株，所述L-高絲氨酸生產菌株中的一個或多個與L-高絲氨酸代謝途徑相關的基因被敲除或弱化，并且/或者一個或多個與L-高絲氨酸代謝途徑相關的基因被過表達或增強，并且/或者一個或多個與L-高絲氨酸代謝途徑相關的基因被突變；

其中，所述被敲除或弱化的基因為thrB、thrL中的一個或兩個；所述被突變的基因為thrA*，且所述thrA*具有抑制產物的反饋抑制的特性；所述被過表達或增強的基因為rhtA、thrA*、ppc、pntAB、asd中的一個或多個。

優選地，所述thrA*為thrA*(G433R)；

具體而言：所述thrB基因的敲除或弱化可阻斷或減弱L-高絲氨酸往L-蘇氨酸的轉化，從而提高L-高絲氨酸的產量；

所述thrL基因為編碼前導肽基因，其敲除或弱化可去除或減弱了轉錄衰減調控，保證thrA基因的轉錄效率；