[發明專利]一種包含糖醇和ATP結合域的基因序列及其在解脂亞羅酵母中表達和功能驗證方法

有效

• 申請號: 202110247016.2
• 申請日: 2021-03-05
• 公開（公告）號: CN113025634B
• 公開（公告）日: 2022-04-08
• 發明（設計）人: 裴疆森;李紅嬌;周蕓琪;金瑋鋆;董建輝
• 申請（專利權）人: 中國食品發酵工業研究院有限公司
• 主分類號: C12N15/54
• 分類號: C12N15/54;C12N9/12;C12N15/81;C12N1/19;C12P7/18;C12R1/645
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本發明公開了一種包含糖醇和ATP結合域的基因序列以及含該序列的解脂亞羅酵母重組菌株的構建方法，屬于微生物基因工程領域。所述的基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，該基因在解脂亞羅酵母菌中表達后，重組菌株對酵母菌種赤蘚糖醇和核糖等碳水化合物的同化性能差異顯著，故推定該基因為具有赤蘚糖醇合成調控能力的新基因。重組后的解脂亞羅酵母菌株，還表現出對正常解脂亞羅酵母赤蘚糖醇發酵液提取后的母液中多種糖醇和一些非發酵性二糖的同化能力，這對改進解脂亞羅酵母的底物利用能力和赤蘚糖醇生產過程廢液綜合利用具有實際應用價值。

技術領域

本發明屬于酵母基因工程和微生物技術領域，具體涉及一種包含糖醇和ATP結合域的基因序列和含此序列的重組菌株構建方法以及重組菌株功能驗證方法。

背景技術

自然界中赤蘚糖醇廣泛存在于酵母、藻類、蘑菇等微生物中，屬于糖醇類天然甜味劑，熱量極低，不易吸濕，高溫時也穩定且具有一定的抗氧化活性，在人體代謝中不引起胰島素水平變化，食用后不對血糖造成較大浮動。口腔中的細菌一般不利用此類甜味劑，長期食用不會引起齲齒。因此，赤蘚糖醇可作為功能性代糖添加至無卡或低卡食品中，應用于醫藥產品也更適合肥胖癥和糖尿病患者。常用微生物發酵法生產赤蘚糖醇，主要以小麥、玉米等淀粉質原料經酶降解為葡萄糖，再由耐高滲酵母如畢赤氏酵母屬（Pichia），耶氏酵母屬（Yarrowia），假絲酵母屬（Candida），球擬酵母屬（Torulopsis），三角酵母屬（Trigonopsis）等作為生產菌株，通過以葡萄糖為底物的發酵及后續過濾分離純化等步驟得到赤蘚糖醇，平均得率約50％，因具備較高的生產效率、反應溫和且成本低而進行工業化的大批量生產。

解脂亞羅酵母主要以葡萄糖和甘油為發酵底物合成赤蘚糖醇。在以葡萄糖為碳源的合成代謝途徑中，經糖酵解，己糖激酶催化葡萄糖生成6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖脫氫酶催化6-磷酸葡萄糖進入磷酸戊糖途徑生成4-磷酸赤蘚糖，在4-磷酸赤蘚糖激酶和赤蘚糖還原酶的催化下生成赤蘚糖醇。宿主菌解脂亞羅酵母（Yarrowia lipolytica）是一種安全的非致病性菌株，已完成全基因組和線粒體測序，基因操作手段完善，能利用廉價底物和多種碳源分泌代謝產物，可通過定向分流代謝途徑來生產具有一定工業價值的化合物，逐漸成為一種酵母表達系統并廣泛應用于食品和醫藥生產中。

發明內容

本發明公開了一種包含糖醇和ATP結合域的基因序列：

① 該基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，由1831個核苷酸組成。

② 由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列經替換、增添、缺失一個或多個核苷酸得到編碼相同功能基因的序列。

③與SEQ ID NO.1所示序列具有75%以上同源性的編碼相同功能基因的序列。本領域技術人員可采用已知方法，例如點突變對本發明基因序列進行突變，經過人工修飾的具有與本發明提供的核苷酸序列75%或者更高同一性的核苷酸序列，只要與該基因序列編碼蛋白有相同功能，均是衍生于本發明的基因序列并且等同于本發明序列。

“同一性”是指與本發明核苷酸序列的相似性。“同一性”包括與本發明SEQ IDNo.1所示序列具有75%或更高同源性的核苷酸序列。同一性可以用計算機序列比對軟件或通過BLAST算法對序列同源性進行評價，兩個或多個序列之間的同一性用百分比表示。

本發明所述的基因序列表達蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，由603個氨基酸組成。對SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，進行不超過10個氨基酸殘基的替代、缺失、增添得到的具有相同功能的蛋白，或與SEQ ID No.2所示的氨基酸序列具有75%或更高同源性且具有相同功能的蛋白，均是衍生于本發明的氨基酸序列并等同于本發明序列。