[發(fā)明專利]基于RAA技術(shù)檢測(cè)I群4型禽腺病毒的引物探針組合及試劑盒

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110238913.7
• 申請(qǐng)日: 2021-03-04
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112746135A
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-05-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄒海濤;馬廣斌;李陽(yáng);馬麗;宋金棟;宋美瑩;李廣森;王永堅(jiān);鹿洪偉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東信達(dá)基因科技有限公司;山東信得科技股份有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 北京同輝知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11357
• 代理人: 于晶晶

本發(fā)明公開(kāi)一種基于RAA技術(shù)檢測(cè)I群4型禽腺病毒的引物探針組合及試劑盒，所述引物探針組合中的引物和探針是以I群4型禽腺病毒特異性Hexon基因?yàn)槟康幕蜻M(jìn)行設(shè)計(jì)獲得，所述引物探針組合應(yīng)用在基于RAA技術(shù)檢測(cè)I群4型禽腺病毒的檢測(cè)中。本發(fā)明中引物探針組合的設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)了I群4型禽腺病毒能夠通過(guò)RAA技術(shù)進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)，彌補(bǔ)了現(xiàn)有傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)的不足，非常適用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，與傳統(tǒng)PCR法相比，RAA法是在恒溫下反應(yīng)，操作簡(jiǎn)單，擺脫了復(fù)雜儀器的束縛，不需變溫，大大縮短了反應(yīng)時(shí)間。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及I群4型禽腺病毒檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)涉及一種基于RAA技術(shù)檢測(cè)I群4型禽腺病毒的引物探針組合及試劑盒。

背景技術(shù)

禽腺病毒是全球家禽和野禽常見(jiàn)的傳染病病原體。多數(shù)禽腺病毒可在健康禽體內(nèi)復(fù)制，癥狀非常輕微或不表現(xiàn)感染癥狀，在混合感染時(shí)，禽腺病毒可成為條件性病原。有時(shí)禽腺病毒作為原發(fā)病原，可引起火雞出血性腸炎，鵪鶉支氣管炎和產(chǎn)蛋下降綜合征等。Ⅰ群禽腺病毒中有A、B、C、D、E 5個(gè)種，12個(gè)血清型。大多數(shù)Ⅰ群禽腺病毒的致病性還未完全明確，不同血清型的致病性有較大差異。較為清楚的是雞包涵體肝炎（IBH）、心包積液綜合征（HPS）和肌胃炎等，很多血清型的毒株都可以引起雞包涵體肝炎，可是引起心包積液綜合征的毒株主要是致病性相對(duì)較強(qiáng)的血清4型毒株。

心包積液綜合征于1987年在巴基斯坦卡拉奇附近一個(gè)叫安卡拉的小鎮(zhèn)發(fā)生和報(bào)道，因此該病被稱作安卡拉病。在剖檢中發(fā)現(xiàn)發(fā)生心包積液綜合癥的心臟很像剝皮后的荔枝，因此也叫做荔枝心臟病。之后，該病逐漸在巴基斯坦、印度、伊朗、伊拉克、阿富汗、土耳其等國(guó)家流行，隨后又在歐洲、俄羅斯、朝鮮、韓國(guó)、日本，美國(guó)、秘魯和智利也有報(bào)道和記載。2010年山東某肉雞場(chǎng)發(fā)生了FADV-8b（IBH）引起的包涵體感染，隨后在山東、江蘇、北京、遼寧、黑龍江、吉林等省份的白羽肉雞和父母代種雞群陸續(xù)發(fā)現(xiàn)此病。2012年江蘇省某蛋雞場(chǎng)發(fā)生了FADV-4引起的心包積液綜合癥（HPS）。2013年后該病在全國(guó)十多個(gè)省市廣泛流行，蛋雞、麻雞以心包積液綜合癥為主，白羽肉雞和父母代種雞以包涵體肝炎為主。2016年發(fā)病區(qū)域有擴(kuò)散趨勢(shì)。目前關(guān)于該病毒的研究主要圍繞形態(tài)學(xué)、致病性、基因序列分析等，還沒(méi)有一種準(zhǔn)確、快速的檢測(cè)方法。

針對(duì)上述問(wèn)題，特提出本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的種種不足，為了解決上述問(wèn)題，現(xiàn)提出一種基于RAA技術(shù)檢測(cè)I群4型禽腺病毒的引物探針組合及試劑盒。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

一種基于RAA技術(shù)檢測(cè)I群4型禽腺病毒的引物探針組合，引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述探針的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，其中，探針的5′端第23位T堿基標(biāo)記羧基熒光素，第24位堿基連接脫堿基位點(diǎn)四氫呋喃，第25位堿基標(biāo)記BHQ1淬滅基團(tuán)，3′端進(jìn)行C3-spacer阻斷修飾。

優(yōu)選的，引物探針組合中的引物和探針是以I群4型禽腺病毒特異性Hexon基因?yàn)槟康幕蜻M(jìn)行設(shè)計(jì)獲得，其中，所述下游引物的核苷酸序列為對(duì)應(yīng)I群4型禽腺病毒特異性Hexon基因的第1091位堿基前后的核苷酸序列的反向互補(bǔ)序列，且下游引物的核苷酸序列中與I群4型禽腺病毒特異性Hexon基因第1091位堿基對(duì)應(yīng)的堿基設(shè)為簡(jiǎn)并堿基R。

優(yōu)選的，所述引物探針組合應(yīng)用在非疾病診斷目的的基于RAA技術(shù)檢測(cè)I群4型禽腺病毒的檢測(cè)中，且基于RAA技術(shù)檢測(cè)I群4型禽腺病毒的檢測(cè)方法包括如下步驟：

（1）配置陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照以及待檢測(cè)樣品的RAA反應(yīng)體系，其中，RAA反應(yīng)體系中所使用的引物探針組合為如上所述的引物探針組合；

（2）RAA反應(yīng)體系擴(kuò)增；

（3）根據(jù)RAA反應(yīng)體系的擴(kuò)增曲線判定待測(cè)樣品中是否含有I群4型禽腺病毒，待測(cè)樣品中是否含有I群4型禽腺病毒的判定方式為：