[發明專利]柔嫩艾美耳球蟲子孢子的分離純化方法和接種方法

在審

• 申請號: 202110227960.1
• 申請日: 2021-03-02
• 公開（公告）號: CN112877215A
• 公開（公告）日: 2021-06-01
• 發明（設計）人: 林瑞慶;周德榮;陸肖;蔡曉懿;方園婷;蔣嘉豪;孟甜;王瑞珍;翁亞彪
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: C12N1/10
• 分類號: C12N1/10;C12N1/02;A01K67/02;C12R1/90
• 代理公司: 廣州新諾專利商標事務所有限公司 44100
• 代理人: 盧頌昇

本發明提供一種柔嫩艾美耳球蟲子孢子的分離純化方法和接種方法，涉及生物技術領域。本發明的分離純化方法包括：取感染雞糞便，加水，過濾；離心，沉淀加入飽和食鹽水，離心，上清液加水得卵囊稀釋液；離心，沉淀加入氯胺T溶液，得孢子化卵囊懸液；離心，沉淀加入飽和食鹽水重懸，離心收集卵囊沉淀；加入次氯酸鈉溶液重懸，收集卵囊；震蕩破碎，待孢子囊全部逸出停止震蕩，離心得到孢子囊，加入胰酶消化液進行消化，過濾離心收集沉淀，得柔嫩艾美耳球蟲子孢子。本發明的接種方法是將上述孢子囊或子孢子精準注射于小雞肌胃和小腸中段，實現成功感染。本發明的純化方法得到的孢子囊和子孢子的純化程度高，實驗操作簡便，注射接種后感染成功率達100％。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，特別是涉及一種柔嫩艾美耳球蟲子孢子的分離純化方法和接種方法。

背景技術

球蟲病被認為是家禽的重要傳染病之一，每年給全世界養禽業造成超過20億英鎊的經濟損失。艾美耳球蟲是引起家禽球蟲病的主要病原，可造成腹瀉、體重減輕、產蛋量減少等癥狀，有時甚至死亡。此外，艾美耳球蟲的感染可促進其他病原體(如產氣莢膜梭菌)的機會性感染。并且，其卵囊對環境的耐受性很強，這使得控制措施變得相當困難。常規的疾病控制策略主要依賴于預防性用藥，但是引起雞球蟲病的艾美耳球蟲已對大多數抗球蟲藥產生了耐藥性。因此，近年來國內外學者對雞球蟲蟲種的鑒定、基因編輯、遺傳穩定性和疫苗開發等方面進行了大量的研究工作。

雞球蟲孢子化卵囊包含4個孢子囊，孢子囊間的遺傳基因存在不一致的現象，但每個孢子囊含2個基因組一致的子孢子。用于分子遺傳學研究的群體必須基因組完全一致，而傳統的單卵囊分離技術得到的產物存在基因組不純的可能性，因此，單孢子囊和單子孢子接種獲取克隆化群體的方式顯得十分重要。已有研究報道，從既有早熟又有抗藥性的卵囊群體中分離出單孢子囊，經分子遺傳學鑒定得出口服接種的后代只來源于2種母系卵囊，說明單孢子囊接種的群體在遺傳基因上是一致的，即真正意義上的克隆化群體。

目前，現有技術已經能夠實現卵囊、孢子囊和子孢子的分離純化，例如采用DE-52陰離子交換色譜純化球蟲子孢子。但是，在這種方法需要耗費的時間較長，涉及的器材較多，為獲取克隆化卵囊群體帶來較高的不穩定性。現有技術中也有利用顯微鏡分離單孢子囊，并建立柔嫩艾美耳球蟲克隆的報道，但是成功率僅為17.8％?，F有技術中還有報道，利用顯微鏡操作吸取單子孢子，并注射于解剖后暴露的雞盲腸內，實現單子孢子的分離與接種，但是其成功率也僅達22％，而且操作難度系數大，精密設備需求度高，給研究帶來諸多不便。

發明內容

基于此，有必要針對上述問題，提供一種柔嫩艾美耳球蟲子孢子的分離純化方法，得到的孢子囊和子孢子的純化程度高，接種后感染成功率大大提升。

一種柔嫩艾美耳球蟲子孢子的分離純化方法，包括以下步驟：

S1、取感染柔嫩艾美耳球蟲的雞的糞便，加水稀釋，過篩網，保留濾液；

S2、將濾液離心，收集沉淀，加入飽和食鹽水重懸，離心，收集上清液，加水稀釋，得到卵囊稀釋液；

S3、將卵囊稀釋液離心，收集沉淀，加入氯胺T溶液，待卵囊孢子化后，得到孢子化卵囊懸液；

S4、將孢子化卵囊懸液離心，收集沉淀，加入飽和食鹽水重懸，離心，收集卵囊；

S5、向卵囊沉淀中加入次氯酸鈉溶液重懸，離心，收集上層的卵囊；

S6、取卵囊，配制成懸液，進行震蕩破碎，待全部孢子囊逸出，停止震蕩，離心，收集沉淀，得到孢子囊；

S7、取孢子囊，配制成懸液，離心收集沉淀，加入胰酶消化液，消化至全部的子孢子釋放，停止消化，離心收集沉淀，配制成懸液，過濾，所得沉淀即為柔嫩艾美耳球蟲子孢子。