[發明專利]一株產還原性脫鹵素酶的菌株及其應用

有效

• 申請號: 202110223546.3
• 申請日: 2021-03-01
• 公開（公告）號: CN112574933B
• 公開（公告）日: 2021-05-14
• 發明（設計）人: 馮志彬;張娟;燕蕊;陳泉炎;程仕偉
• 申請（專利權）人: 魯東大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N9/14;C12P17/12;C12R1/38
• 代理公司: 北京科家知識產權代理事務所(普通合伙) 11427
• 代理人: 沈小明

本發明涉及一株產還原性脫鹵素酶的菌株及其應用，屬于生物技術領域，所述菌株為假單胞菌YtRDases?55，分類命名為假單胞菌Pseudomonas sp.，保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址為中國北京，保藏編號為：CGMCC No.21296，保藏日期2020年12月4日。本發明所提供的假單胞菌YtRDases?55遺傳穩定性好，培養基成分簡單原料成本低，產生的還原性脫鹵素酶活力高，底物特異性強，對底物轉化率高，可直接利用該菌株全細胞催化2,3,6?三氯吡啶脫氯合成2,3?二氯吡啶，具有工業應用前景。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，特別涉及一株生產還原性脫鹵素酶的菌株，以及利用該菌株生產的還原性脫鹵素酶催化制備2,3-二氯吡啶的方法。

背景技術

2,3-二氯吡啶（2,3-dichloropyridine），白色粉狀固體，微溶于水，是新型殺蟲劑氯蟲苯甲酰胺與氰蟲酰胺的關鍵中間體，廣泛應用于醫藥與農藥研究領域。隨著氯蟲苯甲酰胺與氰蟲酰胺市場的日益擴大，作為上述兩個農藥產品的關鍵中間體，2,3-二氯吡啶的需求必將顯著增加，市場前景廣闊。現階段獲得2,3-二氯吡啶的途徑主要以化學合成法為主。化學合成面臨反應時間長，高能耗、有毒副產品及環境污染的難題。如2,3,6-三氯吡啶氫氣還原法，對設備和操作條件要求高，安全操作難度大，一般企業不宜采用。2-氯吡啶合成法，得到2,3-二氯吡啶和2,5-二氯吡啶的混合物，后處理困難，總收率不高。微生物轉化法將是生產2,3-二氯吡啶最具前景的替代生產方法。

還原性脫鹵素酶是一種依賴于VB₁₂和鐵硫團簇的酶，通過還原作用選擇性剪切碳-鹵鍵，可以用于催化2,3,6-三氯吡啶非氧化脫氯生產2,3-二氯吡啶。還原性脫鹵素酶在Sulfurospirillum multivorans、Nitratireductor pacificus等微生物中發現，在環境中有機鹵化污染物降解方面具有應用價值。尚未有關于應用還原性脫鹵素酶催化合成2,3-二氯吡啶的報道。

發明內容

本發明要解決的技術問題在于提供從土壤中分離得到的一株高效生產還原性脫鹵素酶的菌株，并應用該菌株產生的還原性脫鹵素酶酶法制備2,3-二氯吡啶的方法。

本發明所提供的產還原性脫鹵素酶的菌株是從濰坊地區土壤中分離得到，這是一株還原性脫鹵素酶分泌能力較高的菌株，培養方法簡單，生長速度快，不易變異，可以直接用于酶法制備2,3-二氯吡啶。將其編號為YtRDases-55，分類命名為假單胞菌Pseudomonassp.，保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為：中國北京，保藏編號為：CGMCC No.21296，保藏日期2020年12月4日。

本發明還提供利用所述菌株產生的還原性脫鹵素酶催化制備2,3-二氯吡啶的方法如下：

1）菌株活化：挑取菌種劃線接種至斜面培養基，于恒溫培養箱30℃培養16～24h；

2）液體發酵：挑取一環斜面活化菌株接種于裝有發酵培養基的培養容器中，轉速200r/min、溫度30℃，得到還原性脫鹵素酶的發酵液，培養72h，8000r/min離心20min收集菌體細胞；

3）全細胞催化2,3,6-三氯吡啶制備對2,3-二氯吡啶：將2,3,6-三氯吡啶加入體積比10%的甲醇水溶液中，2,3,6-三氯吡啶與甲醇水溶液的質量體積比為：2：1000-10：1000（g/ml），調pH至7.0，攪拌均勻，加入和甲醇水溶液等體積發酵液離心后收集的菌體進行反應，溫度37～60℃，維持轉速在50 r/min，反應3～10h。

進一步，所述的斜面培養基的成分及終濃度：葡萄糖 1g/L、酵母浸粉5 g/L，蛋白胨10 g/L、NaCl 5 g/L和瓊脂 20 g/L，調節含有上述成分溶液的pH為 7.0，121℃高壓蒸汽滅菌20min即得到所述斜面培養基。