[發明專利]構建瘦肉率高、生長快且抗藍耳病和系列腹瀉病的優質豬核移植供體細胞的方法及其應用

有效

• 申請號: 202110197015.1
• 申請日: 2021-02-22
• 公開（公告）號: CN112779292B
• 公開（公告）日: 2023-03-10
• 發明（設計）人: 牛冬;汪滔;馬翔;曾為俊;劉璐;王磊;程銳;趙澤英;段星;陶裴裴;黃彩云
• 申請（專利權）人: 南京啟真基因工程有限公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/65;C12N5/10;A01K67/027
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 傅婷婷;徐冬濤

1.一種用于豬MSTN、SST、CD163及pAPN四基因編輯的CRISPR/Cas9系統，其特征在于，包含Cas9表達載體、針對豬MSTN基因的gRNA表達載體、針對豬SST基因的gRNA表達載體、針對豬CD163基因的gRNA表達載體以及針對豬pAPN基因的gRNA表達載體；所述的Cas9表達載體質粒全序列如SEQ ID NO.2所示；所述的針對豬MSTN基因的gRNA表達載體表達 SEQ IDNO.18 所示的 gRNA，其靶點如 SEQ ID NO. 15 所示，該表達載體由SEQ ID NO.16和SEQID NO.17所示的單鏈DNA退火而成的雙鏈插入載體骨架pKG-U6gRNA所得；所述的針對豬SST基因的gRNA表達載體表達 SEQ ID NO.24 所示的 gRNA，其靶點如 SEQ ID NO.21 所示，該表達載體由SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23所示的單鏈DNA退火而成的雙鏈插入載體骨架pKG-U6gRNA所得；所述的針對豬CD163基因的gRNA表達載體表達 SEQ ID NO.30 所示的gRNA，其靶點如 SEQ ID NO.27所示，該表達載體由SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.29所示的單鏈DNA退火而成的雙鏈插入載體骨架pKG-U6gRNA所得；所述的針對豬pAPN基因的gRNA表達載體表達 SEQ ID NO.36 所示的 gRNA，其靶點如 SEQ ID NO.33 所示，該表達載體由SEQID NO.34和SEQ ID NO.35所示的單鏈DNA退火而成的雙鏈插入載體骨架pKG-U6gRNA所得；載體骨架pKG-U6gRNA的質粒全序列如SEQ ID NO.3所示。

2.權利要求1所述的CRISPR/Cas9系統在構建MSTN、SST、CD163和pAPN四基因敲除的豬重組細胞中的應用。

3.一種敲除MSTN、SST、CD163和pAPN基因的豬重組細胞，其特征在于由權利要求1所述的CRISPR/Cas9系統共轉染豬原代成纖維細胞經驗證后所得。

4.權利要求3所述的重組細胞在構建MSTN、SST、CD163和pAPN四基因敲除的克隆豬中的應用。