[發(fā)明專利]一種gE-HEK293細胞的構(gòu)建方法及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110194448.1
• 申請日: 2021-02-20
• 公開（公告）號: CN112941031B
• 公開（公告）日: 2023-06-27
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 譚小東;周云;莊宗蘭;方超;祁碧玉;楊世龍
• 申請（專利權(quán)）人: 安徽智飛龍科馬生物制藥有限公司;重慶智飛生物制品股份有限公司;北京智飛綠竹生物制藥有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/38;C12N15/85;G01N33/569;G01N33/543
• 代理公司: 北京知聯(lián)天下知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11594
• 代理人: 史光偉;張迎新

本發(fā)明涉及一種gE?HEK293細胞的構(gòu)建方法及其應(yīng)用，所述方法包括如下步驟：構(gòu)建重組質(zhì)粒，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，重組細胞株構(gòu)建：將gE?HEK293細胞和HEK293細胞加壓篩選，獲得初代gE?HEK293細胞，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)后選取gE蛋白表達量最高的單克隆細胞進行傳代培養(yǎng)，直至傳代后的gE?HEK293細胞能夠穩(wěn)定表達gE蛋白，形成最終能夠表達gE蛋白的gE?HEK293細胞。本發(fā)明構(gòu)建的gE?HEK293細胞能夠穩(wěn)定表達gE蛋白，并且可以用于FAMA實驗、流式細胞術(shù)和細胞ELISA檢測VZV?gE的特異性抗體，檢測過程中使用構(gòu)建的gE?HEK293細胞能夠簡化操作過程，快速獲得檢測結(jié)果。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種gE-HEK293細胞的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

水痘是由水痘帶狀皰疹病毒引起的一種疾病，主要見于兒童，在人群中具有極高的感染率。IgG是機體感染水痘后產(chǎn)生的兩種主要中和抗體之一，檢測血清中水痘IgG抗體在水痘血清流行病學(xué)研究、水痘疫苗的免疫效果評價、臨床診斷等方面具有重要意義。Williams等首先在1974年報道了用FAMA(膜熒光抗體)法檢測水痘病毒IgG抗體。因為該方法能區(qū)分水痘的易感者和免疫者，只要未檢測出抗體就表明該個體是VZV(水痘-帶狀皰疹病毒)易感者，只要檢測出抗體，就表明該個體具有免疫力，此外，F(xiàn)AMA法檢測到血清抗體滴度轉(zhuǎn)換，就表明周圍有水痘發(fā)生。FAMA法敏感性高、特異性好、未發(fā)現(xiàn)與其他皰疹病毒產(chǎn)生交叉反應(yīng)，被稱為是水痘IgG抗體檢測的“金標準”。

常規(guī)的FAMA實驗，以VZV感染MRC-5細胞為抗原，熒光標記的抗血清抗體為二抗，檢測血清中抗VZV的特異性IgG抗體，其形成的抗原抗體復(fù)合物主要位于感染細胞表面，熒光顯微鏡下觀察可見膜性環(huán)狀熒光。此方法的結(jié)果判斷受主觀因素影響較大，操作過程繁瑣，需要提前使用病毒感染細胞，試驗耗時長，不宜進行大批量檢測。需要使用到病毒操作，涉及到生物安全，至少需要生物安全二級實驗室才能開展。通常用于FAMA法的抗原細胞，用合適滴度的VZV病毒感染MRC-5細胞，待細胞病變達到++--+++，將病變細胞從細胞培養(yǎng)瓶中消化下來，吸附到載玻片上，經(jīng)固定后再用于檢測。抗原細胞制備復(fù)雜，對細胞病變判斷需要一定經(jīng)驗，不利于實驗重復(fù)性。

流式細胞術(shù)是一種在單個細胞水平上分析細胞特性的定量技術(shù)，現(xiàn)有技術(shù)中可利用流式細胞術(shù)分析腺病毒感染滴度。但采用MRC-5細胞感染水痘病毒后，細胞聚集嚴重，無法進行水痘病毒的滴度檢測。

因此需要一種能夠方便檢測IgG抗體并能夠定量檢測水痘病毒的細胞。

發(fā)明內(nèi)容

針對上述問題，本發(fā)明涉及一種gE-HEK293細胞的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。

一種gE-HEK293細胞的構(gòu)建方法，所述構(gòu)建方法包括如下步驟：

構(gòu)建重組質(zhì)粒：將水痘帶狀皰疹病毒糖蛋白gE基因序列片段按HEK293細胞表達系統(tǒng)進行密碼子優(yōu)化形成目的基因，并將目的基因連接至表達載體上，形成重組質(zhì)粒；

重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染：將重組質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶在30±2℃下反應(yīng)3-5h，利用乙醇沉淀回收法獲得線性化質(zhì)粒，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將線性化質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK293細胞，將能夠表達gE蛋白的HEK293細胞作為初代gE-HEK293細胞；

重組細胞株構(gòu)建：將初代gE-HEK293細胞和HEK293細胞用Hygromycin?B加壓篩選；

待HEK293細胞全部死亡后，將初代gE-HEK293細胞計數(shù)并按照1個細胞/孔的密度鋪板，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)后選取gE蛋白表達量最高的單克隆細胞進行傳代培養(yǎng)，傳代后的gE-HEK293細胞能夠穩(wěn)定表達gE蛋白，形成最終能夠表達gE蛋白的HEK293細胞。

進一步地，所述gE基因序列片段通過在水痘帶狀皰疹病毒糖蛋白gE基因序列的上下游添加Hind?III和Xho?I酶切位點，再通過序列合成的方式獲得gE基因序列片段。