[發明專利]基于環介導等溫擴增技術鑒定大青褶傘的引物組、試劑盒和方法

在審

• 申請號: 202110190526.0
• 申請日: 2021-02-18
• 公開（公告）號: CN112852992A
• 公開（公告）日: 2021-05-28
• 發明（設計）人: 陳愛亮;王楠;高潔;張娟;謝瑞彬;于文杰
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/645
• 代理公司: 北京超凡宏宇專利代理事務所(特殊普通合伙) 11463
• 代理人: 余菲

本發明公開了一種基于環介導等溫擴增技術鑒定大青褶傘的引物組、試劑盒和方法，涉及蘑菇種質鑒定技術領域。本發明公開的引物組包括SEQ ID NO.1?5所示的引物。本發明公開的引物組能夠快速、準確地鑒定或檢測出大青褶傘，具有較高的特異性和靈敏度；本發明對于蘑菇中毒的預防、快速檢測中毒事件中的有毒蘑菇如大青褶傘、以及中毒后的針對性治療和診斷具有重要意義。

技術領域

本發明涉及蘑菇種質鑒定技術領域，具體而言，涉及一種基于環介導等溫擴增技術鑒定大青褶傘的引物組、試劑盒和方法。

背景技術

蘑菇作為一種較大的真菌在全球范圍內分布廣泛，具有很高的營養價值和藥用功效。據統計，目前世界上有超過14,000種蘑菇，而在我國已知有3,800種，其中約有480種是有毒蘑菇。不少有毒蘑菇具有與可食蘑菇相似的形態特征，難以用肉眼分辨。在我國每年有許多食物中毒事件是由誤食有毒蘑菇引起的。其中，大青褶傘(Chlorophyllummolybdites)是一種易被誤食的有毒蘑菇之一。大青褶傘在我國不同地區一年四季均有分布，是離人群最近的毒蘑菇種類。僅2019年我國就發生了55起因誤食大青褶傘而引起的蘑菇中毒事件，涉及至少133名患者。

蘑菇中毒已成為我國亟需解決的食品安全問題之一。對于不同種類的有毒蘑菇，它們含有多種毒素，可導致不同的中毒癥狀。攝入大青褶傘主要導致嚴重的胃腸不適，可持續1-6小時。如果無法得到及時治療，將造成多器官功能的衰竭甚至危及生命。當蘑菇中毒事件發生時，需要有效，簡單且快速的檢測方法以進行準確的臨床治療或法醫分析。在由有毒蘑菇引起的食物中毒事件中，蘑菇樣品經煮熟和消化后會失去其原始形態特征，因此無法通過形態學方法對其完成鑒定。目前已開發多種蘑菇物種鑒定技術，其中基于DNA的分子生物學技術是使用最廣泛的方法。作為生物遺傳物質的基礎，核酸不受年齡，季節，發育階段和環境因素的影響，且具有很高的熱穩定性，不受加工方式的干擾。隨著PCR技術的發展已衍生了多種檢測方法，如實時熒光PCR、聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)和DNA條形碼技術等。但是這些方法需要依賴昂貴的儀器設備并相對耗費時間，無法應用于現場快速檢測中。建立簡單、有效、準確、靈敏的蘑菇菌種鑒定方法有助于中毒發生初期的及時對癥治療。

而目前，缺乏針對大青褶傘的有效鑒定方法。

鑒于此，特提出本發明。

發明內容

本發明的目的在于提供一種基于環介導等溫擴增技術鑒定大青褶傘的引物組、試劑盒和方法。本發明提供的引物組、試劑盒和方法能夠快速、準確地鑒定或檢測出大青褶傘，具有較高的特異性和靈敏度；本發明對于蘑菇中毒的預防、快速檢測中毒事件中的有毒蘑菇如大青褶傘、以及中毒后的針對性治療和診斷具有重要意義。

本發明是這樣實現的：

一方面，本發明提供一種基于環介導等溫擴增技術鑒定大青褶傘的引物組，所述引物組包括：外引物對、內引物對以及環引物；其中，所述外引物對核酸序列如包括SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.4的引物，所述內引物對包括核酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3的引物，所述環引物的核酸序列如SEQ ID NO.5所示。

等溫擴增方法已廣泛應用于病原真菌的物種鑒定其中，環介導等溫擴增技術(loop-mediated isothermal amplification method，LAMP)的應用最為廣泛，已受到越來越多的關注。LAMP反應可在恒定溫度60–65℃下進行，一小時內指數型擴增10⁹-10¹⁰倍目的基因，反應結果可直接通過肉眼在日光下觀察顏色變化得出。經過十余年的發展，LAMP已廣泛用于致病微生物快速檢測、臨床疾病診斷和食品衛生檢查等領域。但在蘑菇菌種鑒定方面，目前沒有針對大青褶傘物種鑒定的相關內容。