[發明專利]褐藻膠裂解酶突變基因、褐藻膠裂解酶突變體、含該突變體的工程菌及構建方法和應用

有效

• 申請號: 202110189613.4
• 申請日: 2021-02-19
• 公開（公告）號: CN112941089B
• 公開（公告）日: 2022-06-10
• 發明（設計）人: 張志凱;遲艷;李峰;王學江;于蒙愛
• 申請（專利權）人: 五洲豐農業科技有限公司
• 主分類號: C12N15/60
• 分類號: C12N15/60;C12N9/88;C12N15/70;C12N1/21;C12P19/00;C12R1/19
• 代理公司: 煙臺雙聯專利事務所(普通合伙) 37225
• 代理人: 姜宏藝

本發明公開了一種褐藻膠裂解酶突變基因、褐藻膠裂解酶突變體、含該突變體的工程菌及構建方法和應用。本發明還公開利用基因工程的技術方法，將該新褐藻膠裂解酶的突變基因克隆到大腸桿菌表達載體上，獲得可異源表達該酶的大腸桿菌重組菌株，用該菌株異源表達來制備的褐藻膠裂解酶突變體mAlgNJU?03，具有降解褐藻酸鈉制備褐藻酸鈉寡糖并改變了寡糖聚合度的功能。本發明提供的褐藻膠裂解酶突變體mAlgNJU?03可廣泛應用于化工、農業、食品、飼料添加、醫藥及海藻遺傳工程等領域。

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及一株褐藻膠裂解酶突變基因、突變體及其應用。

背景技術

我國擁有廣闊的海域面積，其中蘊含著豐富的海洋生物資源，尤其是海藻資源。褐藻主要包括海帶、裙帶等，其細胞壁中富含的褐藻膠是一種直鏈酸性多糖，在天然狀態下，褐藻膠的主要存在狀態為水溶性的褐藻酸鈉(sodium alginate)、褐藻酸鉀等褐藻酸鹽類和水不溶性的褐藻酸(alginic acid)。目前市場上的褐藻酸鈉(商品名為海藻酸鈉)或其他褐藻酸鹽主要是從褐藻中獲得。研究發現降解褐藻酸鈉所得到的寡糖具有多種生物活性，比如免疫調節、促生長、誘導植物抗性和提高蛋白質穩定性等，因而可廣泛應用于化工、農業、食品、飼料添加和醫藥等領域(劉航,天然產物研究與開發,2012,24:201-204)。褐藻酸鈉可用多種方法降解，包括化學降解法、物理降解法和酶降解法。化學降解法以酸降解為主，但該方法降解條件難以控制，操作較復雜，耗時長。物理降解法包括輻射法和超聲法等，一般與其他降解法一起使用，降解產物的極限分子質量為50kDa左右，不易制得寡糖。而用褐藻膠裂解酶降解褐藻酸鈉具有降解條件溫和，得率高等優點，且因為酶的底物專一性，能為后續研究寡糖化學結構提供信息，故而褐藻膠裂解酶逐步成為優先降解褐藻酸鈉的方法。另外，褐藻膠裂解酶還能應用于肺囊腫性纖維化癥的治療、海藻飼料加工及海藻遺傳工程等領域的研究(Wong TY et al.Annual Review of Microbiology,2000,54:289-340)。

褐藻酸裂解酶來源于海洋動植物和多種微生物(包括海洋細菌、土壤細菌和真菌)。褐藻酸鈉裂解酶按其底物專一性可分為兩大類：1,4-D-甘露糖醛酸片段裂解酶(EC4.2.2.3)和1,4-L-古羅糖醛酸片段裂解酶(EC 4.2.2.11)。至今，褐藻膠裂解酶的生產大多依賴原始產酶動植物或微生物來獲得酶蛋白，此種方法雖然能有效的獲得一定量的酶蛋白，但產量有限，成本較高，較難滿足實際應用需求。隨著生物技術的發展，提供了利用基因工程高效生產褐藻膠裂解酶的技術方法。Dong Eun Kim等根據已知的相關功能基因的相似序列設計PCR引物，從Streptomyces sp.ALG-5菌株中克隆到了一個褐藻膠裂解酶突變基因，并在Escherichia coli BL21(DE3)中成功表達(Kim et al.MarineBiotechnology.2009.11:10-16)。采用這一策略必須對相關基因序列有一定的了解才能設計PCR引物，并且找到的是某一類結構或功能相似蛋白質中的新分子，較難發現全新的基因。