[發明專利]一種羧酯酶及其在動力學拆分環己烯甲酸酯生產環己烯甲酸中的應用

有效

• 申請號: 202110187908.8
• 申請日: 2021-02-18
• 公開（公告）號: CN112813131B
• 公開（公告）日: 2022-07-15
• 發明（設計）人: 倪曄;竇哲;陳玄皂;鄭香玉;許國超
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12P41/00
• 分類號: C12P41/00;C12P7/40;C12N9/18;C12N15/55;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 蘇州市中南偉業知識產權代理事務所(普通合伙) 32257
• 代理人: 王玉仙

本發明公開了一種羧酯酶及其在動力學拆分環己烯甲酸酯生產環己烯甲酸中的應用，本發明提供的羧酯酶作為催化劑在不對稱拆分手性環己烯甲酸酯制備手性環己烯甲酸的應用中，底物耐受性好，光學純度高(ee_s值達99％以上)，反應條件溫和，對環境友好，操作簡便，易于工業放大。因此，本發明的羧酯酶及其基因具有很好的工業應用開發前景。

技術領域

本發明屬于酶工程技術領域，尤其涉及一種羧酯酶及其在動力學拆分環己烯甲酸酯生產環己烯甲酸中的應用。

背景技術

(S)-3-環己烯-1-甲酸(分子式：C₇H₁₀O₂，分子量：126.15，沸點：118℃/6mmHg，CAS號為5708-19-0，是新型口服抗凝藥依度沙班的關鍵手性中間體。

手性環己烯甲酸分子結構具有高度對稱性，是合成醫藥、農藥及其它精細化學品的重要手性砌塊。研究人員已開發出多種光學活性手性酸合成的方法，包括動力學拆分和不對稱合成。其中，利用酶法動力學拆分手性酯合成光學活性手性酸的途徑，是生產光學純環己烯甲酸的重要方法。另外，利用化學法合成手性環己烯甲酸的方法包括狄爾斯-阿爾德(Diels-Alder)反應和外消旋酸拆分法，其中Diels-Alder反應是目前合成手性3-環己烯-1-甲酸的主要方法，然而該方法操作難度大，反應條件苛刻，反應步驟繁瑣，收率較低，因此其應用受到限制。另一化學拆分法需要在丙酮中進行至少六次重結晶才可分離出光學純的對映異構體，導致丙酮的大量使用，拆分收率僅20～30％，原子經濟性低。生物催化方法不僅反應條件溫和、對環境友好，具有高度的區域選擇性和立體選擇性，而且避免了生產中有機試劑的大量使用，恰好彌補了化學方法的不足之處，因此近幾年來生物催化的動力學拆分反應在手性酸合成中的應用越來越受到重視。

生物催化法立體選擇性合成環己烯甲酸主要采用商品酶、野生菌或重組工程菌的細胞或游離酶進行催化。在前期的報道中，本實驗室從自然界篩選到了可水解外消旋3-環己烯-1-甲酸甲酯的野生菌，現保藏在中國普通微生物菌種保藏管理中心，編號為CGMCCNo.17220。經過條件優化，菌株JNU9335可以產生233U·L^-1水解酶，在水/異辛烷兩系統中可耐受高達1.0M底物。通過精確控制反應時間實現了(R)-3-環己烯-1-甲酸甲酯的完全水解，最終可獲得(S)-3-環己烯-1-甲酸甲酯，ee_s值為99.6％，分離得率為34.7％(Enzyme.Microb.Tech.,2020,139,109580)。后期構建了JNU9335的鳥槍法基因文庫，通過高通量篩選成功鑒定了目標酯酶AcEst1，可反應底物濃度是2.0M(280g/L)，是目前報道的最高水平，所用催化劑為本實驗室篩選的重組表達的AcEst1(來源于Acinetobactersp.JNU9335，CGMCC No.17220)，反應20h后ee_s99％，分離得到715mM(S)-3-環己烯-1-甲酸甲酯(Bioresource Technol.,2020,317,123984)；雖然也有很多其它報道可以催化環己烯甲酸甲酯的不對稱拆分，但都普遍存在光學活性偏低或底物上載量較低等問題,不具備規模化應用的可行性。2004年，Cihangir T等考察了一批商品酶包括豬肝酯酶PLE、馬肝酯酶HLE和豬胰脂肪酶PPL在20℃條件下水解70mM外消旋3-環己烯-1-羧酸甲酯的效果。其中，PLE反應4h后，產物為(S)-3-環己烯-1-甲酸，光學純度99％，產率為43％；HLE催化產物也為(S)-3-環己烯-1-甲酸，ee值為97％，產率有41％；PPL和前兩者相反，水解產物為(R)-3-環己烯-1-甲酸，ee值為91％，產率為43％(Tetrahedron Asymmetry,2004,15,2057–2060)。然而，上述酶為動物來源的商品酶，其實際應用的過程中存在：價格昂貴、同工酶干擾、批次間差異較大和引入病毒的風險等。2016年，汪釗等人公開了一種商品蛋白酶拆分制備手性3-環己烯-1-甲酸的方法，以外消旋3-環己烯-1-甲酸甲酯為底物，在pH 7.5的磷酸鹽緩沖液中反應，可獲得(S)-3-環己烯-1-甲酸的ee值為99.5％，產率為32.8％(中國專利CN106119303B)。2019年，Xiafen Wu等設計了大腸桿菌酯酶BioH，通過合理的設計提高了其對(S)-3-環己烯-1-甲酸甲酯的對映選擇性。通過空間和芳香相互作用的組合，陽性突變體Mu3(L24A/W81A/L209A)在水解外消旋3-環己烯-1-羧酸甲酯方面具有較高的(S)-選擇性，ee值從32.3％(野生型)提高到70.9％。此外，優化了Mu3在3-環己烯-1-羧酸甲酯水解中的反應條件，在30℃和含有2.5％吐溫80的磷酸鹽緩沖液(pH8.0)中，Mu3可水解40mM底物，轉化率提高了2倍(Biosci.Biotechnol.Biochem.,2019,83,1263–1269)。重組酶BioH雖然具有水解3-環己烯-1-甲酸甲酯的活性，但對映選擇性較低。