[發明專利]一個兼抗黃瓜花葉病毒和馬鈴薯Y病毒的雙價弱毒疫苗

有效

• 申請號: 202110185710.6
• 申請日: 2021-02-11
• 公開（公告）號: CN112961839B
• 公開（公告）日: 2023-05-19
• 發明（設計）人: 原雪峰;劉珊珊;葛玉倩;于成明
• 申請（專利權）人: 山東農業大學
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12N7/04;C12N15/84;C12N15/66;A01N63/40;A01N63/60;A01P1/00;C12R1/94
• 代理公司: 濟南譽豐專利代理事務所(普通合伙企業) 37240
• 代理人: 薛鵬喜

本發明公開了一種兼抗黃瓜花葉病毒和馬鈴薯Y病毒的雙價弱毒疫苗，所述雙價弱毒疫苗含有CMVsubgt;Fny/subgt;分離物的突變型RNA2；所述CMVsubgt;Fny/subgt;分離物的突變型RNA2是在CMVsubgt;Fny/subgt;分離物的RNA2全長序列第2661位之后插入TAATAG以及一段馬鈴薯Y病毒的保守序列；所插入的馬鈴薯Y病毒的保守序列的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示；所述CMVsubgt;Fny/subgt;分離物的突變型RNA2的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。將本發明的雙價弱毒疫苗與含有CMVsubgt;Fny/subgt;分離物RNA1和RNA3的質?；旌辖臃N，可以預防黃瓜花葉病毒和馬鈴薯Y病毒的危害，為田間防治CMV和PVY引起的植物病毒病提供了疫苗材料和有效防治措施。

技術領域

本發明涉及植物病毒學和分子生物學技術領域，具體涉及一個兼抗黃瓜花葉病毒和馬鈴薯Y病毒的雙價弱毒疫苗及其在防治黃瓜花葉病毒和馬鈴薯Y病毒中的應用。

背景技術

煙草是我國重要的經濟作物之一，目前，限制煙草產業發展的主要因素就是煙草病毒病，堪稱煙草的“癌癥”，嚴重影響煙草的品質和質量，因此，對煙草病毒病的防治一直是生產上迫切需要解決的問題。復合侵染是煙草病毒病的特點，一般受侵染的煙草都是同時感染多種病毒病，癥狀復雜，單獨防治一種病害往往效果不好。因此，設計能夠同時抗多種病毒的策略尤為重要。

黃瓜花葉病毒(Cucumer?mosaic?virus，CMV)屬于雀麥花葉病毒科(Bormoviridae)黃瓜花葉病毒屬(Cuucmovirus)，是目前已知的寄主范圍最廣的植物病毒之一，可侵染100多科1200多種植物(Mochizuki?et?al.,2012)。CMV是造成煙草花葉的主要病原，造成植株矮化和畸形嚴重，葉片出現花葉和壞死，也有黃綠相間的斑駁，嚴重時葉片變薄，嚴重影響煙草的質量與產量。馬鈴薯Y病毒(Potato?virus?Y，PVY)屬于馬鈴薯Y病毒科(Potyviridae)中的馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus)，PVY侵染煙草時，主要發生在省長旺期，導致煙草的葉脈壞死，褐脈，黃斑，可導致煙草產量減產20％-50％，嚴重地塊可導致煙草絕收，嚴重影響煙葉的質量和產量(叢鑫等，2014；孫劍萍等，2011)。

對于植物病毒病的防治，最有效的方法是抗病品種的篩選與培育，但其存在育種周期長、抗病品種抗性易喪失等不足。另一種方法是弱毒交叉保護，是利用弱毒突變體侵染，誘導植物自身的免疫系統而防治后期侵染的同樣類型強病毒株系；是一種有效的病毒防治策略。弱毒突變體可以是天然存在的，也可以通過分子生物學手段進行人工制備。

一種弱毒突變體，只能用來防治對應的強病毒。如果想同時防治不同的病毒，就需要幾種不同類型的弱毒突變體。但可以通過在一個骨架病毒中插入異源病毒片段，來達到既防治骨架病毒，又防治插入片段對應的病毒得效果，這種突變型病毒就是多價弱毒疫苗。以黃瓜花葉病毒為基礎病毒載體，能夠兼抗黃瓜花葉病毒和馬鈴薯Y病毒的雙價弱毒疫苗目前還未見有報道。

發明內容

針對上述研究背景，本發明的目的是提供一種兼抗CMV和PVY的雙價弱毒疫苗，為田間防治CMV和PVY引起的植物病毒病提供了疫苗材料和有效防治措施。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

本發明的第一方面，提供一種兼抗黃瓜花葉病毒和馬鈴薯Y病毒的雙價弱毒疫苗，所述雙價弱毒疫苗含有CMV_Fny分離物的突變型RNA2；所述CMV_Fny分離物的突變型RNA2是在CMV_Fny分離物的RNA2全長序列第2661位之后插入TAATAG以及一段馬鈴薯Y病毒的保守序列；所插入的馬鈴薯Y病毒的保守序列的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示；所述CMV_Fny分離物的突變型RNA2的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。

本發明的第二方面，提供上述兼抗黃瓜花葉病毒和馬鈴薯Y病毒的雙價弱毒疫苗的構建方法，包括以下步驟：