[發明專利]一種大腸癌標記物DCD的Q-PCR檢測方法

在審

• 申請號: 202110176271.2
• 申請日: 2021-02-06
• 公開（公告）號: CN112831565A
• 公開（公告）日: 2021-05-25
• 發明（設計）人: 邱芳華;李秋明;龍華婧;劉道利
• 申請（專利權）人: 廣州醫科大學附屬中醫醫院
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 廣州市越秀區哲力專利商標事務所(普通合伙) 44288
• 代理人: 楊艷

本發明涉及體外檢測技術領域，具體涉及一種大腸癌標記物DCD的Q?PCR檢測方法。該方法包括樣品的RNA提取、逆轉錄和Q?PCR擴增。本發明將DCD作為大腸癌候選的診斷指標及治療標靶，先提取細胞或組織的RNA，設置內參引物和DCD基因引物分別對RNA進行逆轉錄，得到兩組不同的擴增產物，再分別進行Q?PCR反應，分別得到兩組擴增產物的熔解曲線和擴增曲線，從而計算出DCD基因的表達水平；然后將其與正常組織或細胞中DCD的mRNA濃度對比，若受試組織或細胞中的DCD的mRNA濃度高于正常的1倍以上，則可認為該受試組織或細胞是的大腸癌組織或大腸癌細胞，有助于大腸癌的早期診斷。

技術領域

本發明涉及體外檢測技術領域，具體涉及一種大腸癌標記物DCD的Q-PCR檢測方法。

背景技術

DCD(Dermcidin)是2001年德國科學家Schittek等人從人體汗液中分離得到的一種天然活性肽，DCD最初被認為在汗腺中有著特異性表達，在汗腺中表達并分泌至汗液中，有一定的抗菌活性。后來的研究發現，DCD也在某些癌癥中表達，包括黑色素瘤、皮膚腫瘤癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌和肝細胞癌。DCD很可能是一個潛在的致癌因素，能作為治療這些癌癥的候選治療標靶。

通過實驗研究證實，DCD在腫瘤發病率位居全球第3位的大腸癌中存在高表達，能成為大腸癌的診斷指標及治療標靶。然而DCD在大腸癌細胞中的檢測方法則尚未系統的建立。

發明內容

為了克服現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種大腸癌標記物DCD的Q-PCR檢測方法，采用Q-PCR技術通過檢測細胞中DCD的mRNA序列，來判斷是否患有大腸癌。

本發明的目的采用如下技術方案實現：

一種大腸癌標記物DCD的Q-PCR檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)樣品的RNA提取；

2)逆轉錄：將步驟1)提取的RNA配制第一鏈cDNA合成反應液，進行cDNA合成反應，得到cDNA；

3)Q-PCR擴增：以步驟2)中的cDNA為模板，用如SEQ ID NO.1所示的上游引物和和SEQ ID No.2所示的下游引物，進行PCR擴增，得到第一擴增產物；其中，第一擴增產物為對照組，即human-ACTB內參基因組；

以步驟2)中的cDNA為模板，用如SEQ ID NO.3所示的上游引物和和SEQ ID No.4所示的下游引物，進行PCR擴增，得到第二擴增產物；其中，第二擴增產物為實驗組，即DCD基因組；

SEQ ID NO.1：CATGTACGTTGCTATCCAGGC；

SEQ ID NO.2：CTCCTTAATGTCACGCACGAT；

SEQ ID NO.3：AGCCAAGGAAGCAGAGATCC；

SEQ ID NO.4：CTTCGACTGCATCTTTTCCTAGT；

4)分析：分別得出第一擴增產物的擴增曲線和熔解曲線以及第二擴增產物的擴增曲線和熔解曲線，計算出DCD基因的相對表達量，再與正常大腸細胞或組織中DCD基因的相對表達量對比，判斷該樣品是否為大腸癌組織或大腸癌細胞。

根據2-△△Ct公式計算基因擴增：2-△△Ct表示的是實驗組DCD基因的表達相對于對照組的變化倍數，使用這一方法可以直接得到DCD基因相對于內參基因的定量。ΔΔCt＝(CtDCD基因-Ct內參基因)實驗組-(CtDCD基因-Ct內參基因)對照組，則實驗組目標基因的表達水平為對照組的2-△△Ct倍。

計算出樣品的DCD基因的相對表達量后，與正常大腸細胞或組織中DCD的mRND濃度進行對比，可得出該樣品是否為腸癌細胞或組織，為臨床提供新的診斷思路。