[發(fā)明專利]檢測探針、試劑盒及端粒酶活性的直接檢測方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202110154325.5
• 申請日: 2021-02-04
• 公開（公告）號: CN112795565A
• 公開（公告）日: 2021-05-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 武靈芝;葉媛;翁麗星;鮑碧清
• 申請（專利權(quán)）人: 南京郵電大學(xué)
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/6825;C12Q1/48
• 代理公司: 南京蘇高專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 32204
• 代理人: 柏尚春

本發(fā)明公開了一種檢測探針、試劑盒及端粒酶活性的直接檢測方法。本發(fā)明所述的檢測探針包括金納米顆粒以及與金納米顆粒連接的探針序列，所述探針序列包括連接段以及用于端粒酶識別的引物段；所述連接段的序列長度為5?8nt；所述引物段的長度為15?20nt。本發(fā)明利用端粒酶對金納米顆粒表面標(biāo)記的探針序列進(jìn)行延伸，當(dāng)端粒延伸后，表面覆蓋不同長度DNA產(chǎn)物的金納米球通過固態(tài)納米孔進(jìn)行識別，實(shí)現(xiàn)了固態(tài)納米孔對端粒酶活性的實(shí)時高靈敏監(jiān)測。本發(fā)明通過端粒DNA鏈固定在金納米球表面，不僅有助于酶的捕獲，提高端粒酶的活性反應(yīng)，同時DNA?金納米球的復(fù)合結(jié)構(gòu)在納米孔檢測中起到信號放大的功能，可以直接對端粒酶活性進(jìn)行實(shí)時監(jiān)測。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于固態(tài)納米孔傳感器檢測領(lǐng)域，特別涉及一種檢測探針、試劑盒及端粒酶活性的直接檢測方法。

背景技術(shù)

端粒是一段具有重復(fù)序列(TTAGGG)的DNA序列，通常存在于細(xì)胞染色體的末端。在細(xì)胞分裂過程中，染色體的復(fù)制會導(dǎo)致端粒的不斷縮短。而端粒酶作為體內(nèi)廣泛存在的一種逆轉(zhuǎn)錄酶，在維持端粒長度以及細(xì)胞生長、分化過程中起到非常關(guān)鍵的作用。端粒酶通過在端粒的3’端不斷的復(fù)制TTAGGG的重復(fù)序列達(dá)到維持端粒長度以及細(xì)胞活性的目的。2009年，ELIZABETN等發(fā)現(xiàn)了端粒酶以及端粒對于細(xì)胞活性的保護(hù)機(jī)制而獲得了諾貝爾醫(yī)學(xué)獎。此后，許多研究表明端粒酶的活性過高可能會誘導(dǎo)細(xì)胞的永久性存活，甚至引發(fā)癌癥。但是，端粒酶活性過低又會加速細(xì)胞衰老，甚至凋亡。在正常人的體細(xì)胞中，端粒酶處于抑制的狀態(tài)，研究發(fā)現(xiàn)在包括胃癌、乳腺癌、宮頸癌、結(jié)腸癌等大多數(shù)癌癥細(xì)胞中，端粒酶的活性明顯高于正常水平。因此，端粒酶活性檢測在癌癥的診療等方面具有重大的研究意義。WEINBERG等發(fā)現(xiàn)，對于端粒酶的抑制可能會導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。不僅如此，越來越多的研究者發(fā)現(xiàn)端粒酶可以作為重要的靶點(diǎn)在癌癥的診斷，治療方面發(fā)揮作用。因此，如何準(zhǔn)確、靈敏、快速地獲得端粒酶活性成為了在臨床診斷和治療方面的一大熱點(diǎn)。

目前應(yīng)用最廣最為經(jīng)典的方法是基于鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)的端粒酶重復(fù)序列擴(kuò)增技術(shù)(PCR-TRAPs)。該方法將端粒延伸方法和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)相結(jié)合，首先需要端粒酶在端粒底物的3’端不斷的復(fù)制TTAGGG的重復(fù)序列，然后用與端粒重復(fù)序列互補(bǔ)的反向引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后利用電泳分離產(chǎn)物。該方法具有一定的靈敏度，但依賴于PCR擴(kuò)增反應(yīng)，操作繁瑣，同時容易受到來自細(xì)胞內(nèi)的其他物質(zhì)的干擾，造成檢測結(jié)果不準(zhǔn)確，因此該方法也不適用于端粒酶有關(guān)藥物的篩選。所以，提供一個簡單直接的端粒酶單分子檢測方案，來實(shí)現(xiàn)端粒酶活性的高靈敏檢測具有十分重要的研究意義。同時，現(xiàn)今的研究中很難提供一個可以表征端粒酶延伸序列的動力學(xué)過程的實(shí)時檢測過程，這對于研究細(xì)胞的生長與凋亡以及癌癥，腫瘤的診療也具有十分重要的研究價值。

納米孔傳感器作為一種單分子檢測工具，具有高通量、無需標(biāo)記等特征，在近幾十年來得到了廣泛研究。該技術(shù)最早用于DNA測序，在DNA傳輸過程中每個堿基通過一個納米級通道(納米孔)時產(chǎn)生不同的離子脈沖信號，可以區(qū)分不同的核苷酸。固態(tài)納米孔通常存在于固態(tài)薄膜上，分離出含有導(dǎo)電電解質(zhì)的兩個腔室，電極浸在每個腔室里。當(dāng)施加一定的偏置電壓在電極上，由此產(chǎn)生的電場使溶液中的電解質(zhì)離子定向運(yùn)動穿過孔隙，形成離子電流信號。當(dāng)溶液中的生物分子進(jìn)入納米孔，當(dāng)孔隙被堵塞時，離子電流會產(chǎn)生波動，形成一系列的阻塞電流信號。當(dāng)分子穿過通道，離子電流回到基線電流。通過分析阻塞信號的幅值和持續(xù)時間，可以確定目標(biāo)分子的物理和化學(xué)性質(zhì)。在測序中，每一個核苷酸都以不同的方式阻斷通道，從而產(chǎn)生不同的振幅和持續(xù)時間，這些信息再轉(zhuǎn)化為DNA序列信息。除DNA測序外，納米孔的無需標(biāo)記、無需放大的單分子檢測技術(shù)還可以在RNA檢測、蛋白質(zhì)檢測等各種重大疾病的生物標(biāo)志物檢測方面得到應(yīng)用。該技術(shù)具有的無標(biāo)記、高通量、低的材料需求的顯著優(yōu)勢，并且不會受PCR所引入的擴(kuò)增偏差的影響，對生物信息進(jìn)行直接讀取，大大簡化了實(shí)驗(yàn)過程，減少誤差，因此非常適用于體內(nèi)超低水平生物靶分子的檢測以及疾病有關(guān)的藥物的篩選，在臨床診療具有很大的應(yīng)用潛力。

發(fā)明內(nèi)容