[發明專利]一種核酸提取用裂解結合液及其試劑盒和應用

在審

• 申請號: 202110153524.4
• 申請日: 2021-02-04
• 公開（公告）號: CN112899266A
• 公開（公告）日: 2021-06-04
• 發明（設計）人: 陳江坡;馬蒙蒙;胖鐵良;孫杰;張志達;陳傳紅;王文軒
• 申請（專利權）人: 北京中科醫學檢驗實驗室有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/6806
• 代理公司: 北京國坤專利代理事務所(普通合伙) 11491
• 代理人: 張國棟

本發明涉及一種細菌核酸提取用裂解結合液，由鹽酸胍，EDTA，tritonX?100，Tris?HCl，NP?40，CTAB的水溶液組成。該裂解結合液可以將傳統的磁珠法核酸提取的先裂解后節后的步驟有機的結合在一起，可以保證所提取的核酸純度好，濃度高。應用本發明提供的裂解結合液制備的核酸提取試劑盒提取核酸時，全部核酸提取過程僅需3個步驟，完成特定核酸提取時間短，克服了現有磁珠法核酸提取方法步驟繁多的缺點；裂解與結合步驟一步完成，減少了操作步驟，該方法更適用于全自動化核酸提取應用。加大樣本處理量和樣本處理速率，快速高通量提取出生物樣品中的核酸。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及一種核酸提取用裂解結合液，還涉及到應用該裂解結合液制備的核酸提取的試劑盒。

背景技術

核酸提取在核酸分子檢測領域是極其關鍵的一步。自1869年Miescher首次成功發現并分離出DNA，以及1957年Meselson M等首次采用密度梯度離心法分離DNA以來，報道了多種核酸提取方法，許多研究者在核酸的提取方法上進行了不懈的探索，對核酸的各種材料和試劑進行了改進，十二烷基磺酸鈉、酚、脲和胍鹽等各種試劑紛紛被應用到核酸提取實驗中，各種用于核酸提取的商品化試劑盒也應運而生。其中，傳統的提取方法主要有：酚抽提法、堿裂解法、CTAB抽提法和EtBr-CsCl梯度離心法。這些傳統提取方法可從不同組織樣本中分離出DNA和RNA，但這些技術中包含沉淀和離心等操作步驟，其所需的生物樣本量較大，且提取的步驟較為繁雜、費時費力，得率也不高，難以實現自動化操作，另外，大部分的傳統方法中還需要用到有毒化學試劑，對操作人員的健康具有潛在危害，因此，伴隨著分子生物學以及高分子材料學的發展，從液相系統中分離核酸的傳統技術逐漸被以固相載體為基礎的新方法所取代，目前常見固相材料有硅膠、玻璃顆粒、硅藻土、陰離子交換載體等。但這些固相法通常需采取數次快速離心、真空抽濾等步驟來實現分離，而且對于樣本需求量大，耗費樣品較多，不便于高通量、自動化操作，嚴重限制了在臨床基因診斷領域的應用。

隨著分子生物學技術的發展，為滿足高通量處理樣本和獲得高質量核酸的實驗要求，核酸提取分離技術也更趨向于簡便快捷、高質量、高純度和高通量發展，核酸質量的好壞直接決定了后續實驗的成敗。近年來分子診斷技術快速發展，隨著基因測序等技術的成熟，成本進一步降低，在臨床上的應用也越來越普遍。分子診斷檢測的樣本類型多達數十種，而處理后產物適用的檢測項目也涵蓋了熒光定量PCR、基因測序、基因芯片、生物質譜等各類分子生物學技術平臺。然而，無論是哪一類檢測項目，準確的檢驗結果無疑依賴于高質量的標本及標本前處理過程。因此臨床分子診斷自動化趨勢將逐步在國內臨床實驗室成為主導，而自動化首先將在目前手工操作較普及且對結果影響最大的核酸提取上實現。

采用磁珠提取法，核酸提取率和提取純度主要受提取液的影響，如裂解液、結合液、洗滌液和洗脫液等，若提取樣品的量和純度不太高，不但不能有效的檢出，甚至影響檢測結果，甚至不能完全滿足后續的實驗要求。在為申請號201110124322.3一種增強的磁珠法核酸提取方法中也對傳統的磁珠法核酸提取進行了改進，因當前的磁珠法核酸提取方法有兩方面不足：首先是RNA的提取效率較低，其次是核酸提取步驟繁多，裂解與結合分為兩步，磁珠在裂解完成之后才能加入溶液中結合核酸，不利于全自動化應用。該發明將樣本的核酸裂解與核酸磁珠結合一步完成，游離的RNA在裂解液中高濃度鹽和異丙醇作用下吸附到磁珠表面，最后通過磁力作用使離心管內磁珠緊貼于離心管壁，吸棄離心管內溶液，從而達到裂解和結合的目的。該發明在于核酸提取僅需4個步驟，分別是裂解與結合、清洗1、清洗2、洗脫，而前3個步驟都是通過加入異丙醇增強了溶液中磁珠吸附核酸的作用，從而增強了磁珠法核酸提取的效率，其裂解結合時，生物樣品、異丙醇與裂解液的體積比為1:1:2。并且在應用于RNA提取時提供了一種高效提取RNA的方法。使得裂解與結合一步完成，在應用于自動化核酸提取時每一步驟的反應試劑可以預先灌裝入該步驟對應的反應艙內，使該發明更適用于全自動化應用。但是異丙醇對眼、呼吸道的黏膜有刺激作用，能損傷視網膜及視神經，揮發性吸入時給人帶來惡心難受感覺。其毒性、麻醉性以及對上呼吸道黏膜的刺激都比乙醇強。接觸高濃度蒸氣出現頭痛、倦睡以及眼、鼻、喉刺激癥狀。食入或吸入大量的蒸汽可引起面紅、頭疼、精神抑郁、惡心、昏迷等。