[發明專利]一種莫干山野生紅托竹蓀菌種的分離和純化方法

有效

• 申請號: 202110123216.7
• 申請日: 2021-01-29
• 公開（公告）號: CN112931058B
• 公開（公告）日: 2022-10-11
• 發明（設計）人: 閆靜;王偉科;周祖法;陸娜
• 申請（專利權）人: 杭州市農業科學研究院
• 主分類號: A01G18/40
• 分類號: A01G18/40;A01G18/20
• 代理公司: 杭州知閑專利代理事務所(特殊普通合伙) 33315
• 代理人: 萬靜

1.一種莫干山野生紅托竹蓀菌種的分離和純化方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）采集莫干山竹林中未開出的完好、硬實野生紅托竹蓀蛋，清除野生紅托竹蓀蛋表面的雜塵，對野生紅托竹蓀蛋進行清洗和消毒；

（2）將野生莫干山野生紅托竹蓀蛋縱向剖開，取出中間第二層的菌裙組織，接種至滅菌后的分離培養基上，將培養基封口后置于黑暗條件下進行分離培養；

所述分離培養基的配方為：葡萄糖20~30 g，蛋白胨2~4 g，磷酸二氫鉀1~3 g，硫酸鎂0.5~2 g，檸檬酸銨0.5~2 g，維生素B1 40~60 mg，含90~110 g馬鈴薯、40-55 g豆粕和70~100g竹林土的混合煮出液，純凈水定容至1L后，加入瓊脂粉11-15g；

所述竹林土為采集到的野生紅托竹蓀蛋周邊2~5cm范圍內的地面以下5~10 cm土層的土壤，去除土壤表面覆蓋的落葉；

所述分離培養基的制備方法為：

（A）馬鈴薯去皮后，按比例將馬鈴薯、豆粕和竹林土加入至純凈水中，大火煮沸后，小火繼續煮一段時間，至溶液中固體物質充分沉淀后，取上清液，得到混合煮出液；

（B）按比例將葡萄糖，蛋白胨，磷酸二氫鉀，硫酸鎂，檸檬酸銨，維生素B1加入到步驟（A）的混合煮出液中，再用純凈水定容至1L，純凈水定容后加入瓊脂粉，充分攪拌后微波爐加熱至沸騰，取出后輕輕攪拌，再重復加熱2~3次，保證瓊脂粉完全融化，得到分離培養基；

（C）待分離培養基冷卻至60~80℃后，封口，進行高壓滅菌，滅菌結束后，冷卻至60~80℃，得到滅菌后的分離培養基；

（3）菌裙組織經步驟（2）分離培養一段時間后，選擇菌絲生長整齊、色澤均勻的培養皿，通過無菌操作挑取菌落尖端菌絲接種到新的分離培養基上，繼續培養一段時間直至培養皿發滿，獲得莫干山野生紅托竹蓀純菌種。

2.如權利要求1所述的莫干山野生紅托竹蓀菌種的分離和純化方法，其特征在于，步驟（1）中，所述野生紅托竹蓀蛋的清洗和消毒方法為：用無菌水沖洗野生紅托竹蓀蛋2~4遍后，用滅菌過的濾紙吸干水分；再用75%的酒精噴灑野生紅托竹蓀蛋的表面，然后用75%的酒精棉球反復擦拭，進行表面消毒。

3.如權利要求1所述的莫干山野生紅托竹蓀菌種的分離和純化方法，其特征在于，步驟（2）中，所述菌裙組織為塊狀，大小為：（5~6）×（5~6）×（3~4）mm。

4.如權利要求1所述的莫干山野生紅托竹蓀菌種的分離和純化方法，其特征在于，步驟（2）中，所述分離培養的條件為：22-28℃下培養2~4天。

5.如權利要求1所述的莫干山野生紅托竹蓀菌種的分離和純化方法，其特征在于，步驟（A）的混合煮出液制備過程中，小火繼續煮的時間為15~20 min。

6.如權利要求1所述的莫干山野生紅托竹蓀菌種的分離和純化方法，其特征在于，步驟（C）中，高壓滅菌的條件為：121-126℃下高壓滅菌20-30min。

7.如權利要求1所述的莫干山野生紅托竹蓀菌種的分離和純化方法，其特征在于，步驟（3）中，繼續培養的條件為：黑暗條件下，22-28℃下培養2~4天。