[發明專利]一種特異性結合鹽酸沙拉沙星核酸適配體的篩選方法

有效

• 申請號: 202110114246.1
• 申請日: 2021-01-28
• 公開（公告）號: CN112662664B
• 公開（公告）日: 2022-04-19
• 發明（設計）人: 李灝;丁于敬;高子涵
• 申請（專利權）人: 北京化工大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12N15/115
• 代理公司: 北京思海天達知識產權代理有限公司 11203
• 代理人: 劉萍

1.一種特異性結合鹽酸沙拉沙星核酸適配體的篩選方法，其特征在于：

1).合成以下序列所示的原始隨機ssDNA文庫和引物：

原始隨機ssDNA文庫具體如下：

5’-AAGGAGCAGCGTGGAGGATA-N40-TTAGGGTGTGTCGTCGTGGT-3’；

上游引物：5’-AAGGAGCAGCGTGGAGGATA-3’

下游引物1：5’-ACCACGACGACACACCCTAA-3’

下游引物2：5’-bio-ACCACGACGACACACCCTAA-3’

2).SELEX技術篩選特異性核酸適配體

2.1配制實驗過程所需溶液

(1)100mL篩選液Selection Buffer配置方法：0.037g KCl，0.011g CaCl₂，0.5844gNaCl，0.019g MgCl₂，0.24g Tris，20μL Tween 20，調pH到7.6，用去離子水補至100mL；

(2)100mL清洗液Washing Buffer配置方法：21g尿素，0.48g Tris，0.37g EDTA﹒Na₂，20μL Tween 20，調pH到8.0，用去離子水補至100mL；

(3)100mL結合洗脫液Binding and Washing(BW)Buffer配置方法：0.12g Tris，0.037gEDTA﹒Na₂，11.68g NaCl，調pH到7.4，用去離子水補至100mL；

(4)100mL氨基磁珠偶聯緩沖液配置方法：1.95g 2-嗎啉乙磺酸，調pH到4.0，用去離子水補至100mL；

(5)100mL氨基磁珠封閉緩沖液配置方法：2.4g Tris，調pH到8.0，用去離子水補至100mL；

(6)100mL鏈霉親和素磁珠的結合緩沖液配置方法：5.84g NaCl，0.24g Tris，0.037gEDTA﹒Na₂，20μL Tween 20，調pH到7.8，用去離子水補至100mL；

2.2氨基磁珠偶聯鹽酸沙拉沙星

(1)使用前將氨基磁珠在磁力分離機上振蕩20秒，混合均勻；用移液槍吸取50μL磁珠加入1.5mL離心管中，用200μL氨基磁珠偶聯緩沖液洗滌磁珠2次，用磁鐵沉降磁珠，用移液槍吸棄上清液；

(2)向清洗好的氨基磁珠中加入60μL 2mg/mL的鹽酸沙拉沙星溶液；同時用冷的去離子水配置50mg/mL的EDC-HCL(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽)，取30μL EDC-HCL溶液加入上述體系，并渦旋，在30℃搖床中120轉震蕩孵育2小時；

(3)在離心管中加入200μL的氨基磁珠封閉緩沖液重懸磁珠，在30℃搖床中120轉震蕩孵育30分鐘；孵育結束后用磁鐵沉降磁珠，用移液槍吸棄上清液；

(4)加入200μL的磷酸緩沖鹽溶液重復洗滌磁珠2次，用磁鐵沉降磁珠，用移液槍吸棄上清液；最后在磁珠中加入100μL磷酸緩沖鹽溶液重懸磁珠，4℃保存以備后續實驗使用；

2.3SELEX體外篩選

(1)取10μL 10μM的ssDNA文庫加入到離心管中，95℃變性5分鐘，然后立即冰水浴10分鐘，加入100μL的Selection Buffer到離心管中混合均勻，25℃下孵育20分鐘，備用；

(2)取偶聯鹽酸沙拉沙星的磁珠100μL，用400μL的Selection Buffer清洗3次，吸棄上清，然后加入步驟(1)中與Selection Buffer混合均勻的ssDNA文庫于25℃的搖床中120轉震蕩孵育1小時；

(3)孵育結束后，磁分離用磁鐵沉降磁珠，再用移液槍棄掉未與鹽酸沙拉沙星-磁珠結合的ssDNA，磁珠用200μL的Washing Buffer清洗3次；

(4)清洗完畢后用磁鐵沉降磁珠，在磁珠中加入50μL Binding and Washing Buffer，混合均勻，95℃水浴5分鐘；然后用磁鐵沉降磁珠，吸取上清液備用；

2.4PCR擴增

以上清液為模板，下游引物2和上游引物進行PCR擴增；PCR反應體系：

PCR反應條件：1、94℃預變性1min；2、94℃變性30s；3、60℃退火30s4、72℃延伸1min；5、72℃延伸2min；6、4℃恒溫保存；其中2-4歩設置循環，循環次數為30次；

2.5次級ssDNA文庫的制備

(1)取70μL的鏈霉親和素磁珠，用200μL的Washing Buffer清洗3次，用磁鐵沉降磁珠，用移液槍吸棄上清，加入100μL鏈霉親和素結合緩沖液混勻磁珠，取PCR產物加入到鏈霉親和素磁珠中，在30℃搖床中120轉振動搖勻孵育30分鐘，磁分離用磁鐵沉降磁珠，再用移液槍吸棄上清液，用200μL的Washing Buffer清洗磁珠3次，磁分離用磁鐵沉降磁珠，再用移液槍吸棄上清液；

(2)向偶聯生物素的PCR產物的鏈霉親和素磁珠中加入50μL 0.2mol/L的氫氧化鈉溶液，在37℃120轉搖床中反應15分鐘，磁分離用磁鐵沉降磁珠用移液槍吸取上清液到離心管中，在離心管中加入2mol/L的稀鹽酸用廣泛pH試紙調至7.0；該次級ssDNA文庫用作下一輪篩選；

2.6檢測

(1)得到的次級文庫分為三份，一份保存，一份用于Q-PCR檢測，一份用于下一輪篩選；

(2)以次級文庫為模板，下游引物1和上游引物進行Q-PCR檢測，分析熔解曲線以判斷擴增的特異性；Q-PCR體系包括：模板2μL，SYRB Mixture 10μL，上游引物0.2μL，下游引物10.2μL，ddH₂O 7μL；

Q-PCR程序包括：95℃預變性30s，并進行30個循環的95℃變性30s、54℃退火30s、70℃延伸15s，最后添加熔解曲線程序；

(3)Q-PCR測得到的Ct值應逐輪降低；熒光閥值設置為100，樣品的Ct值與模板起始拷貝數的對數存在線性關系，模板的量越大，Ct值越小；根據擴增曲線計算Ct值，篩選的次級文庫的Ct值不再降低則停止篩選。