[發(fā)明專利]一種基于葡萄糖信號的便攜式核酸檢測方法

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• 申請日: 2021-01-26
• 公開（公告）號: CN114790492A
• 公開（公告）日: 2022-07-26
• 發(fā)明（設計）人: 徐志南;黃迪;石朱偉;方蒙君
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N11/14;C12R1/93
• 代理公司: 浙江杭州金通專利事務所有限公司 33100
• 代理人: 劉曉春

本發(fā)明提供了一種基于葡萄糖信號的便攜式核酸檢測方法。該設計借助化學偶聯(lián)的方式，利用ssDNA將產糖酶修飾至磁珠上，從而制備功能化磁珠傳感器。具體檢測流程包括：(1)借助等溫擴增技術對核酸檢測片段進行擴增；(2)通過CRISPR/Cas12a體系對擴增片段進行識別，利用其核酸酶活性釋放功能化磁珠上的產葡萄糖酶類；(3)通過磁分離，游離的酶催化底物水解形成葡萄糖。(4)借助便攜式血糖儀可對葡萄糖濃度進行測定，實現(xiàn)對于核酸的定量檢測。該方法操作便攜，無需大型儀器輔助，成本低廉，且選擇性好、靈敏度高，具有一定的應用前景。

技術領域

本發(fā)明屬于生物和化學領域，涉及一種基于葡萄糖信號的便攜式核酸檢測方法。

背景技術

核酸檢測是用分子生物學和生物化學的理論和技術，直接或間接探查核酸的存在狀態(tài)或完整性，并從核酸的結構、復制、轉錄或翻譯水平分析核酸的結構與功能。而研究表明，除朊病毒之外的已知生物體內都含有核酸分子，因而核酸檢測在生命遺傳研究、傳染病檢測、遺傳病診斷、腫瘤研究等多領域具有重要的應用價值。

目前應用最為廣泛的核酸檢測方法包括測序技術和核酸擴增技術。以針對SARS-CoV-2的核酸檢測為例，Wu等人利用測序技術對病毒全基因組進行了表征，并與其它冠狀病毒基因組序列進行了比對，為后續(xù)病毒核酸檢測技術的發(fā)展奠定了基礎。但基于測序技術的核酸檢測方法對樣品質量要求高，依賴于大型儀器，且工作周期長，難以實現(xiàn)快速便攜式的核酸檢測。此外，核酸擴增技術主要針對病毒RNA進行，包括逆轉錄PCR(RT-PCR)，實時逆轉錄PCR(rRT-PCR)，逆轉錄環(huán)介導等溫擴增(RT-LAMP)以及實時RT-LAMP等。例如Noh等于靶向SARS-CoV和MERS-CoV保守的S基因的引物和探針，開發(fā)了一種RT-PCR方法，可以實現(xiàn)高靈敏度的體外診斷，檢出限達50-100copies/mL。Shirato等，分別針對MERS-CoV基因組中開放閱讀框1ab基因和核殼蛋白N基因，構建了兩套RT-LAMP檢測系統(tǒng)，實現(xiàn)了對來自不同MERS-CoV株靶序列的高效擴增和檢測。目前針對SARS-CoV-2的檢測金標準也是通過實時熒光RT-PCR，雖然以之為代表的核酸擴增技術靈敏度高，特異性強，檢測時間較短，但仍存在一些不容忽視的缺陷，如該技術必須依賴專業(yè)儀器和設備，而且對操作人員的要求較高，因此在條件受限的環(huán)境下很難得到廣泛應用。(Nature,2020,579(7798):265-269.Archives ofVirology,2017,162(6):1617-1623.Journal of Virological Methods,2018,258:41-48.Clinical Chemistry,2020,66(7):975-977.Journal of Virological Methods,2020,283:113919.)

針對上述問題，張鋒和Doudna等課題組于近年提出利用以CRISPR Cas系統(tǒng)為核心的核酸檢測技術，利用其切割活性及報告基團可以對信號進行轉導和放大，具有高靈敏度和高特異性。基于CRISPR Cas系統(tǒng)所構建的SHERLOCK和DETECTR等體系也被用于SARS-CoV-2的早期診斷中，但由于此類方法產生的熒光信號需要需熒光儀、酶標儀等大型儀器進行信號輸出，難以廣泛用于核酸靶標在基層上的即時檢測。(Science,2017,356(6336):438-442.Science,2018,360(6387):436-439.New England Journal of Medicine,2020,383(15):1492-1494.Cell,https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.12.001.)

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的在于克服針對現(xiàn)有核酸檢測技術的缺陷，借助CRISPR Cas系統(tǒng)以及功能化磁珠傳感器，構建一種操作便攜，無需大型儀器輔助，成本低廉，且選擇性好、靈敏度高的新平臺。為此，本發(fā)明采用的技術方案如下：

一種基于葡萄糖信號的便攜式核酸檢測方法，其特征在于包括如下步驟：