[發(fā)明專(zhuān)利]一種利用SUMO融合表達(dá)系統(tǒng)制備重組肝素酶I的方法及其所制備的SUMO_肝素酶I融合蛋白

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110097126.5
• 申請(qǐng)日: 2021-01-25
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112980820A
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-06-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 蔣建華;張亮;邢嶺;吳雙;高偉
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 上海寶維醫(yī)藥技術(shù)有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12N9/88
• 分類(lèi)號(hào): C12N9/88;C12N15/70;C12N15/62;C07K19/00
• 代理公司: 上海中外企專(zhuān)利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 31387
• 代理人: 孫旭華

本發(fā)明公開(kāi)了利用SUMO融合表達(dá)系統(tǒng)制備重組肝素酶I的方法及其所制備的肝素酶I，該制備方法包括下列步驟：選擇來(lái)自肝素黃桿菌(Pedobacter heparinus)的肝素酶I序列，其氨基酸序列如SEQIDNo.1所示，共384aa；去除信號(hào)肽序列，獲得肝素酶I的DNA序列，如SEQIDNo.2；將所述肝素酶I的DNA序列插入帶有N端SUMO蛋白標(biāo)簽的pSMART載體質(zhì)粒；將正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單克隆，通過(guò)發(fā)酵和純化獲得融合蛋白；用SUMO蛋白酶將SUMO標(biāo)簽蛋白從融合蛋白上切割下來(lái)，即獲得肝素酶I。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：提高目標(biāo)蛋白質(zhì)的可溶性、促進(jìn)目標(biāo)蛋白質(zhì)的正確折疊，避免形成包涵體；降低純化成本、提高純化效率；SUMO蛋白標(biāo)簽分子量較小，對(duì)肝素酶I的酶活性影響較小，獲得純化的肝素酶I。

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及涉及一種利用SUMO融合表達(dá)系統(tǒng)制備重組肝素酶I(Heparinase I)的方法。

背景技術(shù)

肝素酶主要從一些利用肝素為碳源的細(xì)菌中分離得到，最初來(lái)源于肝素黃桿菌(Pedobacter heparinus)，從肝素黃桿菌中分離純化出的肝素酶有三種，分別為肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III。肝素酶的主要作用是降解肝素，在酶降解法生產(chǎn)低分子肝素和超低分子肝素中有廣泛應(yīng)用。

目前用于低分子肝素生產(chǎn)的肝素酶產(chǎn)品主要有兩種來(lái)源：一是直接從產(chǎn)肝素酶的微生物中發(fā)酵提取(深圳市海普瑞藥業(yè)股份有限公司，CN102286448B)；二是通過(guò)基因工程技術(shù)構(gòu)建重組肝素酶工程菌，發(fā)酵提取重組肝素酶。

直接從產(chǎn)肝素酶的微生物(如肝素黃桿菌等)中提取肝素酶I，發(fā)酵條件和純化工藝相對(duì)復(fù)雜，通過(guò)菌種選育提高產(chǎn)量的潛力有限。

基因工程重組技術(shù)已廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)制備，在構(gòu)建工程菌時(shí)，選擇合適的蛋白純化標(biāo)簽，與目標(biāo)蛋白質(zhì)形成融合蛋白，可以提高蛋白質(zhì)的可溶性、屏蔽毒性蛋白、促進(jìn)蛋白質(zhì)的正確折疊、增強(qiáng)對(duì)高溫和蛋白酶的耐受性。目前已有肝素酶I融合蛋白生產(chǎn)工藝，如專(zhuān)利號(hào)CN103992995B，名稱(chēng)為一種高表達(dá)水溶性肝素酶I融合蛋白及其編碼基因

采用基因工程重組技術(shù)在大腸桿菌系統(tǒng)中生產(chǎn)肝素酶I等外源蛋白質(zhì)時(shí)面臨兩個(gè)挑戰(zhàn)：一是所用蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)水平較低；二是所表達(dá)的蛋白質(zhì)被錯(cuò)誤折疊進(jìn)不溶性的聚集體——包涵體中，提取和復(fù)性困難。

而類(lèi)似谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶標(biāo)簽(GST-Tag)、麥芽糖結(jié)合蛋白標(biāo)簽(MBP-Tag)、轉(zhuǎn)錄抗終止因子A標(biāo)簽(NusA-Tag)等融合蛋白標(biāo)簽，它們的分子量較大(26-55kDa)，會(huì)干擾目標(biāo)蛋白質(zhì)的正常功能，并且在表達(dá)和后續(xù)純化過(guò)程中去除標(biāo)簽等環(huán)節(jié)相對(duì)降低了目標(biāo)蛋白質(zhì)的產(chǎn)率。

發(fā)明內(nèi)容

為解決現(xiàn)有技術(shù)的缺陷和不足，本發(fā)明的目的是提供一種利用SUMO融合表達(dá)系統(tǒng)制備重組肝素酶I(heparinase I)的方法，以極大地提高目標(biāo)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平、穩(wěn)定性和可溶性，提高目標(biāo)蛋白質(zhì)的活性及產(chǎn)率。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種利用SUMO融合表達(dá)系統(tǒng)制備重組肝素酶I(heparinase I)的方法，包括下列步驟：

S01：選擇來(lái)自肝素黃桿菌(Pedobacter heparinus)的肝素酶I序列，其氨基酸序列如SEQIDNo.1所示，共384aa；

S02：去除信號(hào)肽序列，獲得肝素酶I的DNA序列，如SEQIDNo.2；

S03：將所述肝素酶I的DNA序列插入帶有N端SUMO蛋白標(biāo)簽的pSMART載體質(zhì)粒；

S04：將正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單克隆，經(jīng)發(fā)酵和純化獲得SUMO_肝素酶I融合蛋白；