[發(fā)明專利]一種鑒別非洲豬瘟野毒株和基因缺失株的三重?zé)晒舛縋CR檢測引物及試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110084102.6
• 申請(qǐng)日: 2021-01-21
• 公開（公告）號(hào): CN112646934B
• 公開（公告）日: 2021-08-31
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張桂紅;黃釗;王衡;龔浪;許志穎
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 廣州粵高專利商標(biāo)代理有限公司 44102
• 代理人: 段卉

本發(fā)明公開了一種鑒別非洲豬瘟病毒野毒株和基因缺失株的三重?zé)晒舛縋CR檢測引物及試劑盒。本發(fā)明提供了一組檢測非洲豬瘟病毒野毒株和基因缺失株的特異性引物和探針，通過RT?qPCR方法同時(shí)檢測非洲豬瘟病毒野毒株B646L基因和缺失株的EGFP、mCherry基因，能夠鑒別樣本是非洲豬瘟病毒野毒株還是基因缺失株。該檢測方法靈敏度高，特異性強(qiáng)，B646L、EGFP和mCherry基因陽性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒最低檢測濃度分別為5.94×10^?9ng/μL、9.67×10^?9ng/μL、5.85×10^?9ng/μL。該方法檢測范圍廣泛，能檢測出多種非洲豬瘟病毒基因缺失株，且檢測過程快速，高效，適合進(jìn)行大批量檢測，為鑒別非洲豬瘟病毒野毒株與基因缺失毒株提供了新手段，可用于生產(chǎn)實(shí)踐中對(duì)非洲豬瘟病毒野毒株和基因缺失株的快速鑒定。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種鑒別非洲豬瘟野毒株和基因缺失株的三重?zé)晒舛縋CR檢測引物及試劑盒。

背景技術(shù)

非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)是一種高度傳染性和高度致死性家豬疾病的病原體，該病毒引起的非洲豬瘟(African swine fever，AS F)是一種烈性豬傳染性疾病，對(duì)豬養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前生物安全和疫苗是預(yù)防和控制ASF流行病的最有效和最經(jīng)濟(jì)的方法，監(jiān)控豬群是否被病原體感染是做好生物安全的重中之重。

ASFV基因缺失減毒疫苗已成為最有希望的ASF疫苗候選者，世界各大豬病研究機(jī)構(gòu)都在大力研發(fā)有效的ASFV基因缺失疫苗。目前各個(gè)研究所和高校構(gòu)建了多種ASFV基因缺失毒株，缺失的基因有MGF505-1R、MGF360-12L、MG F360-13L、MGF360-14L、MGF505-2R、MGF505-3R、CD2V、I177L、MGF360-18R、DP71L和DP96R。而大多研究所構(gòu)建的ASFV基因缺失毒株所插入的篩選基因?yàn)镋GFP和mCherry或RPF(RFP與mCherry具有高同源性)，而ASFV野毒不能檢測出EGFP以及mCherry基因。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，國內(nèi)某研究所構(gòu)建了以EGFP和mCherry替換靶基因的ASFV△MFG△CD2v，另外一個(gè)研究所構(gòu)建以E GFP和RFP替換靶基因的ASFV△MFG△CD2v，梅島疾控中心制備了用mCher ry替換靶基因的ASFV△I177L毒株，插入以上三種篩選基因的缺失毒株進(jìn)行的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均表明其可100％抵抗親本毒株攻擊。若ASFV基因缺失毒株成功上市，那么能夠準(zhǔn)確區(qū)分ASFV野毒株與基因缺失毒株的檢測方法是必不可少的。

目前，在多種基因缺失毒株疫苗研究的背景下，專利CN111676327A、CN111074000A、CN111020062A雖然都公開了一種區(qū)分檢測非洲豬瘟野毒株和基因缺失株的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法、試劑盒，但都僅僅局限于區(qū)分檢測1種或2種基因缺失株，其應(yīng)用明顯受到了限制，所以亟需建立了一種新的更廣泛地鑒別非洲豬瘟野毒株及多種變異株的熒光定量PCR方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)中區(qū)分鑒別非洲豬瘟野毒株和基因缺失株的不足，提供一種更加準(zhǔn)確、廣泛地區(qū)分檢測非洲豬瘟野毒株與多種基因缺失株的三重?zé)晒舛縋CR檢測引物及試劑盒。

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一組檢測非洲豬瘟野毒株和基因缺失株的三重?zé)晒舛縋CR特異性引物。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一組檢測非洲豬瘟野毒株和基因缺失株的特異性熒光探針。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供所述引物和/或所述探針在制備檢測非洲豬瘟野毒株和/或基因缺失株試劑盒中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種檢測非洲豬瘟野毒株和/或基因缺失株的三重?zé)晒舛縋CR檢測試劑盒。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)的：