[發明專利]一種評估冠心病預后分子標志物NFIA及其逆轉錄引物、擴增引物和應用

在審

• 申請號: 202110075722.3
• 申請日: 2021-01-20
• 公開（公告）號: CN112746103A
• 公開（公告）日: 2021-05-04
• 發明（設計）人: 韓勇軍;吳鴻;高水波;王新洲;高海霞;常紅波;劉珊珊
• 申請（專利權）人: 河南省中醫院（河南中醫藥大學第二附屬醫院）
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 北京冠榆知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11666
• 代理人: 朱亞琦

1.一種評估冠心病預后分子標志物NFIA，其特征在于，為非編碼RNA，其轉錄本長度為140個核苷酸，該核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示。

2.一種評估冠心病預后分子標志物NFIA的逆轉錄引物，其特征在于，逆轉錄引物的核苷酸序列為序列表中SEQ ID No.2所示。

3.一種評估冠心病預后分子標志物NFIA的擴增引物，其特征在于，擴增引物包括上游引物和下游引物，上游引物和下游引物為序列表中SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示。

4.如權利要求1所述的評估冠心病預后分子標志物NFIA在制備評估冠心病預后實時熒光定量PCR檢測試劑盒中的應用。

5.根據權利要求4所述的評估冠心病預后分子標志物NFIA在制備評估冠心病預后實時熒光定量PCR檢測試劑盒中的應用，其特征在于，所述的評估冠心病預后實時熒光定量PCR檢測試劑盒包括：權利要求2所述的評估冠心病預后分子標志物NFIA的逆轉錄引物、權利要求3所述特異性擴增引物、內參基因18S表達的特異性擴增引物序列，其上游引物和下游引物序列為序列表中SEQ ID No.4和SEQ ID No.5、從血漿中提取miRNA以及進行逆轉錄和熒光定量PCR的試劑。

6.根據權利要求5所述的評估冠心病預后分子標志物NFIA在制備評估冠心病預后實時熒光定量PCR檢測試劑盒中的應用，其特征在于，所述的評估冠心病預后實時熒光定量PCR檢測試劑盒包括：

(1)從冠心病或健康者中抽提總RNA所用試劑：包括Trizol液20mL、氯仿80mL、異丙醇80mL、抑制RNA降解溶劑40mL、體積分數為75％的乙醇30mL，DEPC水10mL；

(2)以總RNA為模板進行逆轉錄所用試劑：包括評估冠心病預后分子標志物NFIA的逆轉錄引物：濃度為10μM，30μL；內參基因18S的下游引物：濃度為10μM，30μL；逆轉錄反應緩沖液5×RT Buffer 150μL；逆轉錄酶M-MLV濃度200U/μL，50μL；

(3)將cDNA實時定量PCR：包括NFIA實時熒光定量PCR特異性引物：濃度均為3μM，各25μL；內參基因18S表達的特異性擴增引物：濃度均為3μM，各25μL；實時熒光定量SYBR染料SYBRGreen qPCR Mix 500μL；無RNA酶的水25μL。

7.根據權利要求5所述的評估冠心病預后分子標志物NFIA在制備評估冠心病預后實時熒光定量PCR檢測試劑盒中的應用，其特征在于，評估冠心病預后實時熒光定量PCR檢測試劑盒的檢測方法為：

(1)血漿RNA的抽提；

(2)NFIA RNA的逆轉錄；

(3)利用NFIA的特異性引物進行實時定量PCR；

(4)NFIA表達量的數據分析：采用相對定量方法2^-△△Ct法。

8.根據權利要求7所述的評估冠心病預后分子標志物NFIA在制備評估冠心病預后實時熒光定量PCR檢測試劑盒中的應用，其特征在于，在步驟(1)中：

(1-1)取100μL血漿加入已盛有1ml的Trizol液的EP管中，充分混合均勻；

(1-2)室溫放置5分鐘，然后加入200μL的氯仿，蓋緊EP管并劇烈搖蕩30秒，然后再12000轉/分鐘離心10分鐘；

(1-3)取上層水相于一新的EP管中，加入500μL異丙醇，溫和顛倒混勻；室溫放置10分鐘，12000轉/分鐘離心10分鐘；

(1-4)小心地棄去上清液，加入1mL的體積分數為75％乙醇，渦旋混勻，4℃下12000轉/分鐘離心5分鐘；重復操作一次；

(1-5)棄去上清液，室溫或真空干燥5～10分鐘；用50μL DEPC水將RNA溶解；

(1-6)RNA濃度測定：用核酸濃度測定儀進行測定，吸1μL RNA樣品加至樣品孔，根據讀數直接確定RNA的濃度。核酸濃度測定儀的測定的OD260/OD280比值，比值在1.8-2.0之間認為RNA純度很好；最后，RNA貯存于-80℃冰箱備用。