[發明專利]一種基于RT-QPCR的卵巢癌復發風險評估方法

在審

• 申請號: 202110065934.3
• 申請日: 2021-01-20
• 公開（公告）號: CN112662744A
• 公開（公告）日: 2021-04-16
• 發明（設計）人: 凌雪峰
• 申請（專利權）人: 浙江大學濱海產業技術研究院
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851
• 代理公司: 北京衛智暢科專利代理事務所(普通合伙) 11557
• 代理人: 陳佳

本發明公開了一種基于RT?QPCR的卵巢癌復發風險評估方法，其特征在于：其方法包括如下步驟：首先通過醫療器械獲得受試者的外泌體樣本以及卵巢癌患者的病理標本，對外泌體樣本進行離心處理，然后準備實驗所需的生物標記物、外泌體提取試劑、檢測試劑、前后引物、試管、移液槍等；本發明可以根據生物標記物水平生成卵巢癌復發風險評估報告，供醫生進行診斷和選擇治療方式，能夠根據卵巢癌生物標記物測量在卵巢癌腫瘤中的濃度，提高測量的準確性，為醫生判斷病情提供可靠依據，解決了目前不便于利用生物標記物對卵巢癌患者的癌細胞進行檢測，同時不能對卵巢癌的術后癌細胞進行追蹤和檢測，從而無法對卵巢癌復發風險進行評估的問題。

技術領域

本發明涉及卵巢癌評估技術領域，具體為一種基于RT-QPCR的卵巢癌復發風險評估方法。

背景技術

RT-QPCR的全稱是實時熒光定量(Real Time Quantitative PCR)，屬于第二代PCR技術。與常規的PCR技術相比，RT-QPCR可對DNA起始模板進行定量，同時可以對整個擴增反應進行實時監控。RT-QPCR根據反應體系中加入的熒光基團所積累的熒光信號強度變化，對PCR反應中的每一個循環擴增產物進行實時監控。

卵巢惡性腫瘤是女性生殖器官常見的惡性腫瘤之一，發病率僅次于子宮頸癌和子宮體癌。卵巢惡性腫瘤中以上皮癌最多見，其次是惡性生殖細胞腫瘤。其中卵巢上皮癌死亡率占各類婦科腫瘤的首位，對女性生命造成嚴重威脅。由于卵巢深居盆腔，體積小，缺乏典型癥狀，難以早期發現。因此，探尋切實有效的卵巢癌卵巢切除術后早期復發相關預警分子標志，闡明其與卵巢癌早期復發轉移的關系，這對提高卵巢癌術后治療效果、評估卵巢癌早期復發風險、判斷預后和個體化治療有著至關重要的意義。

目前不便于利用生物標記物對卵巢癌患者的癌細胞進行檢測，同時不能對卵巢癌的術后癌細胞進行追蹤和檢測，從而無法對卵巢癌的復發風險進行評估，導致不能給患者篩選出抑制患者卵巢癌復發的治療方法。

發明內容

本發明的目的在于提供一種基于RT-QPCR的卵巢癌復發風險評估方法，以解決上述背景技術中提出的問題。

為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：一種基于RT-QPCR的卵巢癌復發風險評估方法，其方法包括如下步驟：

(1)物品準備：首先通過醫療器械獲得受試者的外泌體樣本以及卵巢癌患者的病理標本，對外泌體樣本進行離心處理，然后準備實驗所需的生物標記物、外泌體提取試劑、檢測試劑、前后引物、試管、移液槍等；

(2)標本處理：制備卵巢癌組織石蠟切片，將石蠟切片放在烤箱中加熱，然后進行切片脫臘，將切片依次浸泡在二甲苯I、二甲苯II和二甲苯III中，接著進行切片水化，將切片依次浸泡在無水乙醇、90％乙醇、80％乙醇和75％乙醇中，使用PBS清洗切片3次，每次為5分鐘，加入核纖層蛋白A抗體后，使切片在4℃冰箱中放置16小時后取出，室溫復溫15分鐘后使用PBS清洗4次，每次為5分鐘；

(3)顯色處理：切片放入EDTA修復液中浸泡，沸水浴后冷卻至室溫，將3％雙氧水溶液滴加在載玻片上，靜置一段時間后甩去多余液體，接著使用DAB進行顯色處理，然后用自來水沖洗，蘇木精復染5分鐘，自來水沖洗10分鐘，然后使用5％鹽酸酒精脫色5秒，氨水反藍15秒，最后用自來水沖洗浸泡10分鐘；

(4)標本檢測：將組織切片以此置于80％乙醇、95％乙醇、無水乙醇、二甲苯II和二甲苯I中進行浸泡，電吹風吹干后，加入中性樹脂進行蓋玻片覆蓋，最后利用顯微鏡和成像裝置隨機選取卵巢癌組織標本進行拍攝檢測，得出標本中的生物標記物濃度；

(5)樣本比對：向外泌體樣本中加入外泌體提取試劑，然后使用移液器吹打直至混合物形成絮狀膠體，將混合物放入離心機中離心后棄去上清液，收集沉淀備用，沉淀即為提取的外泌體，然后通過檢測設備獲取待檢測樣本的CA125數據、HE4數據和PA數據，將獲得的生物標記物的濃度與對照樣品比較；