[發明專利]一種基于RT-QPCR的卵巢癌復發風險評估方法

在審

• 申請號: 202110065934.3
• 申請日: 2021-01-20
• 公開（公告）號: CN112662744A
• 公開（公告）日: 2021-04-16
• 發明（設計）人: 凌雪峰
• 申請（專利權）人: 浙江大學濱海產業技術研究院
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851
• 代理公司: 北京衛智暢科專利代理事務所(普通合伙) 11557
• 代理人: 陳佳

1.一種基于RT-QPCR的卵巢癌復發風險評估方法，其特征在于：其方法包括如下步驟：

(1)物品準備：首先通過醫療器械獲得受試者的外泌體樣本以及卵巢癌患者的病理標本，對外泌體樣本進行離心處理，然后準備實驗所需的生物標記物、外泌體提取試劑、檢測試劑、前后引物、試管、移液槍等；

(2)標本處理：制備卵巢癌組織石蠟切片，將石蠟切片放在烤箱中加熱，然后進行切片脫臘，將切片依次浸泡在二甲苯I、二甲苯II和二甲苯III中，接著進行切片水化，將切片依次浸泡在無水乙醇、90％乙醇、80％乙醇和75％乙醇中，使用PBS清洗切片3次，每次為5分鐘，加入核纖層蛋白A抗體后，使切片在4℃冰箱中放置16小時后取出，室溫復溫15分鐘后使用PBS清洗4次，每次為5分鐘；

(3)顯色處理：切片放入EDTA修復液中浸泡，沸水浴后冷卻至室溫，將3％雙氧水溶液滴加在載玻片上，靜置一段時間后甩去多余液體，接著使用DAB進行顯色處理，然后用自來水沖洗，蘇木精復染5分鐘，自來水沖洗10分鐘，然后使用5％鹽酸酒精脫色5秒，氨水反藍15秒，最后用自來水沖洗浸泡10分鐘；

(4)標本檢測：將組織切片以此置于80％乙醇、95％乙醇、無水乙醇、二甲苯II和二甲苯I中進行浸泡，電吹風吹干后，加入中性樹脂進行蓋玻片覆蓋，最后利用顯微鏡和成像裝置隨機選取卵巢癌組織標本進行拍攝檢測，得出標本中的生物標記物濃度；

(5)樣本比對：向外泌體樣本中加入外泌體提取試劑，然后使用移液器吹打直至混合物形成絮狀膠體，將混合物放入離心機中離心后棄去上清液，收集沉淀備用，沉淀即為提取的外泌體，然后通過檢測設備獲取待檢測樣本的CA125數據、HE4數據和PA數據，將獲得的生物標記物的濃度與對照樣品比較；

(6)風險評估：將確定的生物標記物的濃度與生物標記物濃度的參考頻率分布進行比較，并從生物標記物濃度的頻率分布中讀出十分位數值，讀出的十分位數值是濃度值，即在參考頻率中的濃度值。以所測樣本中的濃度是否符合過高或過低的標準，來判斷細胞代謝是否異常，進而評估受試者卵巢癌的進展或復發風險，并生成評估報告供醫生診斷和選擇治療方式。

2.根據權利要求1所述的一種基于RT-QPCR的卵巢癌復發風險評估方法，其特征在于：所述步驟(1)中，外泌體來自血液、血清、漿膜液、血漿、淋巴、尿、腦脊液、唾液、分泌組織以及器官的粘膜分泌物、陰道分泌物、和腹水。

3.根據權利要求1所述的一種基于RT-QPCR的卵巢癌復發風險評估方法，其特征在于：所述步驟(1)中，生物標記物為卵巢癌生物標記物，包括CA125，HE4和PLG，生物標記物的檢測試劑為單克隆抗體。

4.根據權利要求1所述的一種基于RT-QPCR的卵巢癌復發風險評估方法，其特征在于：所述步驟(2)中，烤箱的溫度為65℃，且加熱時間為8-10小時。

5.根據權利要求1所述的一種基于RT-QPCR的卵巢癌復發風險評估方法，其特征在于：所述步驟(2)中，切片在二甲苯I、二甲苯II和二甲苯III中的浸泡時間為10分鐘，切片在無水乙醇、90％乙醇、80％乙醇和75％乙醇中的浸泡時間為5分鐘。

6.根據權利要求1所述的一種基于RT-QPCR的卵巢癌復發風險評估方法，其特征在于：所述步驟(3)中，沸水浴的時間為5分鐘，靜置的時間為15分鐘且溫度控制在37℃。

7.根據權利要求1所述的一種基于RT-QPCR的卵巢癌復發風險評估方法，其特征在于：所述步驟(3)中，DAB顯色時間為2-10分鐘，在顯微鏡下掌握染色程度，在達到滿意效果后放入清水中終止染色，且自來水沖洗時間為10分鐘。

8.根據權利要求1所述的一種基于RT-QPCR的卵巢癌復發風險評估方法，其特征在于：所述步驟(4)中，組織切片在80％乙醇和95％乙醇中的浸泡時間為3分鐘，組織切片在無水乙醇中的浸泡時間為5分鐘，組織切片在二甲苯II和二甲苯I中的浸泡時間為10分鐘。