[發明專利]一種檢測腸道病毒CVB3的方法

有效

• 申請號: 202110058295.8
• 申請日: 2021-01-14
• 公開（公告）號: CN112813199B
• 公開（公告）日: 2022-07-15
• 發明（設計）人: 混旭;王如昊;林健健;高杰;鄧陸平;秦娜娜;王明競;張慧
• 申請（專利權）人: 青島科技大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6825;C12Q1/6844
• 代理公司: 青島中天匯智知識產權代理有限公司 37241
• 代理人: 袁曉玲

本發明屬于電化學和分析化學領域，本發明的目的在于提供一種基于原位重組酶聚合酶擴增光致電化學生物傳感器檢測CVB3的方法。利用重組酶聚合酶擴增，將擴增產物原位連接到電極上，擴增產物上的生物素與溶液中的鏈霉親和素標記的堿性磷酸酯酶作用，堿性磷酸酯酶再催化溶液中的底物對氨基苯基磷酸單鈉水解生成游離的電子供體對氨基苯酚，對氨基苯酚增強修飾電極的光致電化學反應從而產生增強的光電信號，實現對CVB3的檢測，該方法具有高的靈敏度，方法簡單。

技術領域

本發明屬于分析化學與光致電化學傳感器領域，具體為一種基于原位重組酶聚合酶擴增光致電化學生物傳感器檢測CVB3的方法。

背景技術

柯薩奇B3病毒(Coxsackievirus B3，CVB3)是腸道病毒屬的一種，具有較高的發病率和死亡率。這種小型的單鏈RNA病毒會引起多種癥狀。比如：常見于五歲以下的兒童的手足口病，重度急性弛緩性麻痹，腦膜炎以及新生兒器官衰竭。但是發展快速、靈敏的CVB3分子診斷技術具有挑戰性。本發明的目的在于提供一種基于原位重組酶聚合酶擴增光致電化學生物傳感器檢測CVB3的方法。利用重組酶聚合酶擴增(RPA)，將擴增產物原位連接到電極上，擴增產物上的生物素與溶液中的鏈霉親和素標記的堿性磷酸酯酶作用，堿性磷酸酯酶再催化溶液中的底物對氨基苯基磷酸酯水解生成游離的電子供體對氨基苯酚，對氨基苯酚增強修飾電極的光致電化學反應從而產生增強的光電信號。在最佳條件下，光致電化學信號與CVB3的濃度在0.1fM～100fM范圍內呈現出良好的線性關系，LOD為30aM。此外，該方法具有良好的穩定性、重現性和選擇性，為CVB3檢測提供了一種新的思路，為進一步研究便攜式臨床樣品處理和分析裝置奠定了基礎。

發明內容

鑒于現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種基于原位重組酶聚合酶擴增光致電化學生物傳感器檢測CVB3的方法。

本發明的目的是這樣實現的：用ZnSeNSs/AuNPs/BNNSs修飾碳糊電極，構建光致電化學傳感器以實現對CVB3的測定；一種基于原位重組酶聚合酶擴增光致電化學生物傳感器檢測CVB3的方法。首先，利用光電活性物質修飾電極，然后在電極上固定正向引物，當有目標物存在時，擴增得到含生物素的產物，將鏈霉親和素標記的堿性磷酸酯酶識別并捕獲在電極上，再水解溶液中的底物對氨基苯基磷酸酯，生成電子供體對氨基苯酚，對氨基苯酚增強光電活性物質ZnSeNSs/AuNPs/BNNS的光電信號，根據光電信號的強弱實現對CVB3的測定，具體包括如下步驟：

復合材料ZnSeNSs/AuNPs/BNNSs的制備

稱取20mg的氮化硼粉末加入到盛有50.0mL的乙二醇溶液的燒杯中，超聲剝離2h后使氮化硼均勻的分散在溶液中，制得氮化硼納米片。之后將該燒杯置于磁力攪拌器上勻速攪拌，同時用制備的5mM的氫氧化鈉溶液滴定，直至溶液pH達到10.0。隨后，將燒杯轉移到恒溫水浴加熱攪拌器上，并向燒杯中加入2.0ml 0.0240mol/L氯金酸，在100℃恒溫水浴中加熱4h，加熱完成后，將燒杯中的溶液分裝到離心管中并分別離心三次(12000r/min，10min)。離心后，收集沉淀物在80℃下干燥2h。獲得了AuNPs/BNNSs材料。稱取0.0150gAuNPs/BNNSs，分散于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，將分散液置于4℃冰箱中使用。稱取0.0150g塊狀硒化鋅分散于DMF中，超聲剝離8h后得到ZnSeNSs。最后，吸取2mL AuNPs/BNNSs和2mL ZnSeNSs分散液轉移到同一離心管中，超聲波振動使溶液均勻混合，制得ZnSeNSs/AuNPs/BNNSs復合材料。

CVB3含量的測定