[發明專利]一種水貂IFN-ε成熟肽的制備方法

有效

• 申請號: 202110053096.8
• 申請日: 2021-01-15
• 公開（公告）號: CN112661835B
• 公開（公告）日: 2022-06-24
• 發明（設計）人: 張海玲;盧士英;白雪;廉士珍;胡博;章沙沙;張蕾;張東亮;李雙雙;李虹曄
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院特產研究所;吉林大學
• 主分類號: C07K14/555
• 分類號: C07K14/555;C12N15/20;C12N15/70;A61K38/21;A61P31/12;A61P31/14
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產權代理有限責任公司 11139
• 代理人: 馬鑫

本發明公開了一種水貂IFN?ε成熟肽的制備方法。本發明還公開了一種優化后的水貂IFN?ε成熟肽的編碼核苷酸序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本發明通過構建含有優化后的編碼水貂IFN?ε成熟肽基因的重組表達載體，并在大腸桿菌中成功表達。對其抗病毒活性進行分析，結果顯示，得到的重組水貂IFN?ε成熟肽具有明顯的抗病毒活性。本發明的提出研制開發具有抗病毒活性的基因工程干擾素制劑，提供了一種有效的技術手段。

技術領域

本發明涉及一種干擾素的制備方法，特別涉及一種水貂IFN-ε成熟肽的制備方法。本發明屬于生物技術領域。

背景技術

干擾素(Interferon，IFN)是一類具有廣泛生物學活性的蛋白質，具有調節機體免疫功能、抗病毒等作用，是機體防御系統的重要組成部分。自從Isaacs和Lindenmann發現干擾素以來已經有50多年的歷史，人們對IFN的研究、開發及應用從未停止過。目前，IFN已被證實在人醫臨床上對多種病毒病的輔助治療效果顯著。2003Kotenko等根據IFN蛋白家族基于它們的基因序列、染色體定位和受體特異性分為三型，即Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型干擾素，Ⅰ型包括IFN-α、β、ω、ε、κ、δ、τ、ζ等，Ⅱ型干擾素由單基因家族IFN-γ構成，又稱為免疫干擾素。1999年首次報道了人的ε-干擾素(IFN-ε)，其主要在肺臟、腦、小腸和生殖系統組織中表達，之后老鼠、豬、犬的IFN-ε基因逐步被報道。IFN-ε被認為在生殖功能中起到重要作用，在哺乳動物胎盤保護病毒感染及早期胎盤發育有重要作用。截止目前，只有人、恒河猴、牛和犬的IFN-ε的生物學功能有相關報道，還未見水貂(Mustela vison)IFN-ε基因克隆和表達方面的相關研究報道。

近幾年我國毛皮動物產業發展較迅速，是國際上少數毛皮動物養殖業發達的國家之一，由于水貂犬瘟熱、細小病毒病和阿留申病毒病等危害養貂業傳染病時常發生，造成嚴重經濟損失。這些病毒性傳染病發病急，死亡率高，普通藥物治療效果不理想，因此研制開發具有抗病毒活性的基因工程干擾素制劑，是一種理想的選擇。

發明內容

本發明的目的之一在于提供一種優化后的水貂IFN-ε成熟肽的編碼核苷酸序列。

本發明的目的之二在于提供一種水貂IFN-ε成熟肽的制備方法。

為了達到上述目的，本發明采用了以下技術手段：

本發明的一種優化后的水貂IFN-ε成熟肽的編碼核苷酸序列，所述的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

進一步的，本發明還提出了所述的核苷酸序列在制備水貂IFN-ε成熟肽中的應用。

更進一步的，本發明還提出了一種水貂IFN-ε成熟肽的制備方法，包括以下步驟：

(1)合成優化后的水貂IFN-ε成熟肽的編碼核苷酸序列，如SEQ ID NO.1所示，與TA克隆載體連接構建得到含有優化后的水貂IFN-ε成熟肽的編碼核苷酸序列的載體；

(2)設計用于擴增水貂IFN-ε成熟肽基因的引物，引物序列如下：

上游：5’–CGGGGTACCGACGACGACGACAAG TTAGAACTGAAACTG-3’；

下游：5’-CCGCTCGAG TCAAACAATGGTCCAG；

以稀釋后的含有優化后的水貂IFN-ε成熟肽的編碼核苷酸序列的載體溶液為模板，采用上述引物進行PCR擴增，PCR產物回收純化后，與表達載體連接并轉化E.coli.感受態細胞中，經PCR及酶切鑒定后，得到含有優化后的水貂IFN-ε成熟肽的編碼核苷酸序列的表達載體；

(3)將步驟(2)中得到的含有優化后的水貂IFN-ε成熟肽的編碼核苷酸序列的表達載體轉化BL21(DE3)感受態細胞，當菌液OD₆₀₀數值達到0.4～0.6時加入IPTG誘導表達，37℃恒溫搖床培養；