[發明專利]一種水貂IFN-ε成熟肽的制備方法

有效

• 申請號: 202110053096.8
• 申請日: 2021-01-15
• 公開（公告）號: CN112661835B
• 公開（公告）日: 2022-06-24
• 發明（設計）人: 張海玲;盧士英;白雪;廉士珍;胡博;章沙沙;張蕾;張東亮;李雙雙;李虹曄
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院特產研究所;吉林大學
• 主分類號: C07K14/555
• 分類號: C07K14/555;C12N15/20;C12N15/70;A61K38/21;A61P31/12;A61P31/14
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產權代理有限責任公司 11139
• 代理人: 馬鑫

1.一種優化后的水貂IFN-ε成熟肽的編碼核苷酸，其特征在于所述的核苷酸序列如SEQID NO.1所示。

2.權利要求1所述的核苷酸在制備水貂IFN-ε成熟肽中的應用。

3.一種水貂IFN-ε成熟肽的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）合成優化后的水貂IFN-ε成熟肽的編碼核苷酸序列，如SEQ ID NO.1所示，與TA克隆載體連接構建得到含有優化后的水貂IFN-ε成熟肽的編碼核苷酸序列的載體；

（2）設計用于擴增水貂IFN-ε成熟肽基因的引物，引物序列如下：

上游：5’ –CGGGGTACCGACGACGACGACAAGCTGGAACTGAAACTGG-3’；

下游：5’-CCGCTCGAGTTATTTAGACAGTTTA；

以稀釋后的含有優化后的水貂IFN-ε成熟肽的編碼核苷酸序列的載體溶液為模板，采用上述引物進行PCR擴增，PCR產物回收純化后，與表達載體連接并轉化E.coli.感受態細胞中，經PCR及酶切鑒定后，得到含有優化后的水貂IFN-ε成熟肽的編碼核苷酸序列的表達載體；

（3）將步驟（2）中得到的含有優化后的水貂IFN-ε成熟肽的編碼核苷酸序列的表達載體轉化BL21(DE3)感受態細胞，當菌液OD₆₀₀數值達到0.4～0.6時加入IPTG誘導表達，37℃恒溫搖床培養；

（4）培養結束后，取出菌液，離心，去除上清液體保留沉淀；用PBS對沉淀進行重懸后，離心去除上清液體保留沉淀，用1/10原菌液體積的PBS進行重懸，應用Ni-NTA純化蛋白，純化后的蛋白即為水貂IFN-ε成熟肽，置-80℃凍存。

4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，步驟（1）中所述的TA克隆載體為pMD18-T載體。

5.如權利要求3所述的方法，其特征在于，步驟（2）中所述的表達載體為pET-32a表達載體。

6.如權利要求3所述的方法，其特征在于，步驟（2）中水貂IFN-ε成熟肽基因擴增反應體系為：10×Eх TaqBuffer 2.5μL，2.5mmol/μL dNTP 4μL，25pmol/μL上、下游引物各1μL，25pmol Taq DNA聚合酶1μL，加入3μL 稀釋100倍后的pMD18-T/MiIFN-ε質粒溶液為模板，用滅菌去離子水補足25μL；反應條件為：將25μL反應液混勻后，于PCR儀上進行擴增，循環參數為95℃預變性5min，94 ℃45s，53℃ 45s，72℃50s，34個循環后72℃延伸10min。

7.按照權利要求3-6任一項所述的方法制備得到的水貂IFN-ε成熟肽。

8.權利要求7所述的水貂IFN-ε成熟肽在制備抗病毒制劑中的用途。