[發明專利]大腸桿菌偏嗜性可溶性豬PD-1重組蛋白的制備及應用

在審

• 申請號: 202110052249.7
• 申請日: 2021-01-15
• 公開（公告）號: CN112661837A
• 公開（公告）日: 2021-04-16
• 發明（設計）人: 王選年;朱艷平;劉佳;何勇;岳鋒;孫國鵬;郭東光;李鵬;李文明;劉金宵
• 申請（專利權）人: 新鄉學院
• 主分類號: C07K14/705
• 分類號: C07K14/705;C12N15/12;C12N15/70;A61K39/12;A61K39/39;A61P31/20
• 代理公司: 鄭州市華翔專利代理事務所(普通合伙) 41122
• 代理人: 張愛軍

本發明涉及一種大腸桿菌偏嗜性可溶性豬PD?1重組蛋白的制備及應用，其中可溶性豬PD?1重組蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，利用基因克隆技術得到經過密碼子偏嗜性修飾的豬PD?1基因的可溶性重組蛋白，該可溶性豬PD?1重組蛋白能有效提高PCV2疫苗免疫后PCV2的抗體水平以及機體免疫力，增強豬對PCV2疫苗的免疫應答，提高接種動物的免疫力，可解決現有技術PCV2疫苗免疫后效果不理想的問題。

技術領域

本發明涉及一種大腸桿菌偏嗜性可溶性豬PD-1重組蛋白的制備及應用，屬于生物醫藥領域。

背景技術

豬圓環病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)病是目前危害世界養豬業的重要疫病之一，PCV2的致病力與毒株類型直接相關。PCV2分型的依據是ORF2的序列差異。PCV2主要包括PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d和PCV2e在內的五個亞型，其中PCV2b是當前主要流行的基因型。當前國內呈現不同基因亞型同時流行的新形勢，PCV2a和PCV2b混合感染增多，PCV2d也出現感染增多并且成為感染的主要亞型。在中國，PCV2流行毒株中PCV2b毒株的毒力顯著高于PCV2a，這也可能是豬圓環病毒病產生嚴重危害的重要原因。因此，需要研究新的疫苗或疫苗佐劑，用于PCV2的預防。

PCV2感染后造成機體的免疫抑制，形成嚴重的經濟損失。目前，豬PCV2感染后T細胞免疫抑制性受體及其調節機制的研究還不清楚。PCV2感染使CD4⁺和CD8⁺ T淋巴細胞數量減少，造成免疫抑制和免疫損傷。PCV2和/或共同感染病原體的宿主免疫調節被認為是臨床疾病發展的關鍵。混合感染豬瘟病毒與豬繁殖與呼吸綜合征病毒或者單獨感染豬流感病毒，能夠導致豬T細胞表面抑制性受體細胞毒T淋巴細胞相關抗原4(CytotoxicTlymphocyte-associated antigen-4,CTLA-4，又稱CD152)、程序性細胞死亡因子1(Programmed death 1，PD-1，又稱CD279)的表達量上升。自然感染PCV2時，PD-L1和它的配體PD-L2的表達量均上升，PD-1/PD-L1通路激活發揮免疫負調節作用，在造成機體免疫抑制發揮著重要作用。用抗PD-1/PD-L1的抗體或可溶性PD-1蛋白阻斷抑制受體與其相關配體之間的相互作用，可以逆轉T細胞衰竭，增強細胞介導的免疫反應。

因此，本發明旨在制備可溶性豬PD-1重組蛋白阻斷PCV2感染時免疫抑制受體PD-1與配體對相關細胞因子的轉錄變化的影響，評價可溶性豬PD-1重組蛋白對PCV2產生的免疫抑制的調節作用，增強機體的免疫反應，為PCV2新型疫苗增強劑或佐劑的研制奠定基礎，也為PCV2的防治提供新策略。

發明內容

針對現有技術的不足，本發明的目的是提供一種大腸桿菌偏嗜性可溶性豬PD-1重組蛋白的制備及其在PCV2疫苗中的應用，旨在提高PCV2疫苗免疫后PCV2抗體水平以及機體免疫力，解決現有技術PCV2疫苗免疫后效果不理想的問題。

為了實現上述目的，本發明所采用的技術方案是：

一種可溶性豬PD-1重組蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

編碼可溶性豬PD-1重組蛋白的DNA分子，所述DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

所述的可溶性豬PD-1重組蛋白的制備方法，包括以下步驟：

(1)將權利要求2所述的DNA分子克隆入表達質粒pET-32a(+)中，獲得重組表達載體pET-32a-PD1；

(2)將步驟(1)獲得的重組表達載體pET-32a-PD1轉化至大腸桿菌Rosetta工程菌株中，挑取單菌落于37℃培養作為種子液；

(3)將步驟(2)獲得的種子液按體積比1:100接種于含Amp的YT培養液中，37℃培養至OD₆₀₀值為0.5～1.0，加入IPTG，進行誘導培養；