[發明專利]一種用于傳代干細胞的無動物源傳代方法

在審

• 申請號: 202110048348.8
• 申請日: 2021-01-14
• 公開（公告）號: CN112680412A
• 公開（公告）日: 2021-04-20
• 發明（設計）人: 康悅;趙峰
• 申請（專利權）人: 遼寧省腫瘤醫院
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 沈陽亞泰專利商標代理有限公司 21107
• 代理人: 馬維駿

本發明屬于生物醫藥技術領域，涉及一種用于傳代干細胞的無動物源傳代方法，具體涉及一種臨床級干細胞無動物源成分消化液、消化終止液的制備及干細胞無動物源傳代方法。一種用于傳代臨床級干細胞的無動物源傳代方法包括以下步驟：提取人羊膜、臍帶間充質干細胞，常規培養至第三代，進行細胞鑒定；將第三代人羊膜、臍帶間充質干細胞接種于75cm²培養瓶中培養，待匯合度達到80?90%；應用無動物源成分消化液、消化終止液將人羊膜、臍帶間充質干細胞傳代。本發明提供的用于傳代干細胞的無動物源傳代方法，既符合無動物源成分標準，又能有效消化干細胞至單細胞形態，進而均勻接種干細胞，達到最佳培養狀態。

技術領域

本發明屬于生物醫藥技術領域，涉及一種用于傳代干細胞的無動物源傳代方法，具體涉及一種臨床級干細胞無動物源成分消化液、消化終止液的制備及干細胞無動物源傳代方法。

背景技術

干細胞是一類具有自我更新和多向分化潛能的細胞。研究表明，干細胞在一定條件下能誘導分化成多種構成人體的功能細胞，是形成人體各種組織、器官的種源細胞，是人體器官再生和修復的秘密所在。

無動物源成分培養基是臨床級干細胞生產過程中提取培養常用的一類培養基，因其生產過程中不接觸任何含有提取自動物來源的組分，故能夠有效的避免異種蛋白過敏及異種病原體感染。目前，已有幾個國內外品牌的無動物源成分培養基獲得了美國FDA認證，為干細胞培養及臨床應用提供了新途徑。

目前發現的絕大多數干細胞均為貼壁細胞，其生長有賴于細胞培養瓶，在細胞增殖的過程中需要將貼壁細胞從細胞培養瓶上消化下來以進行進一步操作。傳統的胰蛋白酶提取自豬的胰腺，在應用過程中難以避免異種蛋白過敏及豬來源病原體感染。近期發明的溫和消化酶及溫和細胞解離試劑等消化液能夠代替胰蛋白酶進行傳代消化，但由于缺乏胰蛋白酶相關組分，導致消化過程延長以及消化不均勻等缺陷，容易形成細胞團塊，嚴重影響干細胞培養狀態。

發明內容

針對現有技術存在的問題，本發明的目的是提供一種臨床級干細胞無動物源成分消化液、消化終止液的制備及干細胞無動物源傳代方法，本發明提供的用于傳代干細胞的無動物源傳代方法，既符合無動物源成分標準，又能有效消化干細胞至單細胞形態，進而均勻接種干細胞，達到最佳培養狀態。

為實現上述目的，本發明采用以下技術方案。

一種用于消化干細胞的無動物源成分的消化液，以濃度單位mg/L計，是由以下濃度的組分組成：EDTA-2Na 100～150、重組人胰蛋白酶50～100、磷酸氫二鉀50～70、氯化鉀350～450、碳酸氫鈉300～400、氯化鈉7000～9000。

一種用于終止干細胞消化的消化終止液，以濃度單位mg/L計，是由以下濃度的組分組成：氯化鈉7000～9000、十二水合磷酸氫二鈉100～150、氯化鉀350～450、磷酸二氫鉀50～70、硫酸鎂80～100、氯化鈣100～150、D-葡萄糖900～1100、碳酸氫鈉300～400、人血白蛋白350～450。

一種用于傳代干細胞的無動物源傳代方法，具體包括以下步驟。

步驟1、取出應用無動物源成分培養基培養中的干細胞，棄去培養基，應用PBS清洗細胞2次，吸出培養瓶中的液體。

步驟2、按25cm²/mL將上述無動物源成分消化液加入培養瓶中，使細胞完全浸入消化液中，棄去多余消化液。

步驟3、置于37℃，飽和濕度、體積分數為5％的CO₂培養箱中1～2分鐘。

步驟4、取出培養瓶，按V_{消化終止液}:V_{無動物源成分消化液}＝1：1體積加入上述消化終止液并混勻，用吸管輕柔收集細胞懸液。

步驟5、1000rpm離心5分鐘，棄上清。