[發(fā)明專利]一種木瓜酶制劑的高效制備方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110026367.0
• 申請日: 2021-01-08
• 公開（公告）號: CN112813057A
• 公開（公告）日: 2021-05-18
• 發(fā)明（設計）人: 白新鵬;劉亞文;黃慶成
• 申請（專利權）人: 海南大學
• 主分類號: C12N9/50
• 分類號: C12N9/50;C12N9/20
• 代理公司: 海南盛億專利代理事務所(普通合伙) 46005
• 代理人: 吳燕梅

1.一種木瓜酶制劑的高效制備方法，其特征在于，包括以下具體操作步驟：

S1、木瓜酶制劑粗品的制備

選取當天采集的新鮮木瓜制成木瓜漿，并在木瓜漿中加入固體亞硫酸鈉，在室溫下攪拌至完全溶解，調節(jié)pH至5.5-6.0，冷凍干燥后得到所述木瓜酶制劑粗品；

S2、木瓜蛋白酶粗酶制品溶液和木瓜脂肪酶粗酶制品的制備

將步驟S1制得的木瓜酶制劑粗品溶解于L-半胱氨酸溶液中，攪拌混合均勻，所得混合液離心處理后用定性分析濾紙過濾，所得濾液即為所述木瓜蛋白酶粗酶制品溶液，所得沉淀即為所述木瓜脂肪酶粗酶制品；

S3、木瓜脂肪酶制劑的制備

向步驟S2所得木瓜脂肪酶粗酶制品中加入pH＝5.5的磷酸緩沖液，攪拌均勻后離心處理，除去上清液，收集沉淀，重復上述操作若干次，所得沉淀冷凍干燥后得到的凍干粉即為所述木瓜脂肪酶制劑；

S4、木瓜蛋白酶的分離純化

配置雙水相體系，其中水相為質量百分濃度為12-24％的無機鹽水溶液，有機相為質量百分濃度為12-24％的PEG無水乙醇溶液；向所述雙水相體系中加入步驟S2所得的木瓜蛋白酶粗酶制品溶液，常溫下超聲震蕩處理后靜置分相；取分相后的PEG有機相通過強陽離子交換法得到木瓜蛋白酶的鹽溶液，再經過透析法截取相對分子質量為3500的組分，得到木瓜蛋白酶水溶液，冷凍干燥后得到的凍干粉即為所述木瓜蛋白酶制劑。

2.根據(jù)權利要求1所述木瓜酶制劑的高效制備方法，其特征在于：步驟S1中所述固體亞硫酸鈉的使用量占所述木瓜漿質量的0.1-1％。

3.根據(jù)權利要求1所述木瓜酶制劑的高效制備方法，其特征在于：步驟S1中為使用2mol/L的檸檬酸調節(jié)pH。

4.根據(jù)權利要求1所述木瓜酶制劑的高效制備方法，其特征在于：步驟S2中所述木瓜酶制劑粗品為在4℃下溶解于L-半胱氨酸溶液中。

5.根據(jù)權利要求1所述木瓜酶制劑的高效制備方法，其特征在于：步驟S2中為使用自動攪拌器攪拌混合30-50min；所述離心處理的離心轉速為8000-12000rpm，離心時間為10-20min。

6.根據(jù)權利要求1所述木瓜酶制劑的高效制備方法，其特征在于：步驟S3中所述木瓜脂肪酶粗酶制品與所述磷酸緩沖液的料液比為1：5。

7.根據(jù)權利要求1所述木瓜酶制劑的高效制備方法，其特征在于：步驟S3中所述木瓜脂肪酶粗酶制品與所述磷酸緩沖液混合后先在4℃下攪拌35-45min后再進行離心處理；所述離心處理的離心轉速為8000-12000rpm，離心時間為10-15min。

8.根據(jù)權利要求1所述木瓜酶制劑的高效制備方法，其特征在于：步驟S4中所述雙水相體系與所述木瓜蛋白酶粗酶制品溶液總系統(tǒng)中各組分的質量百分比如下：無機鹽水溶液20-35％、PEG無水乙醇溶液20-40％、木瓜蛋白酶粗酶制品溶液20-30％，余量為去離子水。

9.根據(jù)權利要求1所述木瓜酶制劑的高效制備方法，其特征在于：步驟S4中所述PEG為PEG 2000、PEG 4000或PEG 6000；所述無機鹽為硫酸鈉、碳酸鈉、磷酸鈉、檸檬酸鈉、硫酸銨、檸檬酸鉀或磷酸二氫鈉。

10.根據(jù)權利要求1所述木瓜酶制劑的高效制備方法，其特征在于：步驟S4所述強陽離子交換法中所用填料為SP-瓊脂糖凝膠FF，所用離子交換柱的平衡緩沖液為pH＝4.8的PBS緩沖液，所用洗脫緩沖液為pH＝4.8的PBS緩沖液和1-2mol/L的NaCl水溶液的混合。