[發明專利]一種SalI限制性內切酶的制備方法

在審

• 申請號: 202110020913.X
• 申請日: 2021-01-08
• 公開（公告）號: CN112813087A
• 公開（公告）日: 2021-05-18
• 發明（設計）人: 于博文;李建輝;單永超
• 申請（專利權）人: 上海詠科生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N9/22;C12N15/62;C12R1/19
• 代理公司: 上海宛林專利代理事務所(普通合伙) 31361
• 代理人: 張明

本發明公開了一種SalI限制性內切酶的制備方法，包括以下步驟：一、合成SalIM和SalI的編碼基因，分別如SEQ ID NO.1所示和SEQ ID NO.2所示，分別構建至相應載體中，獲得帶有SalIM基因的重組載體和融合了純化標簽的SalI蛋白表達質粒；二、將帶有SalIM基因的重組載體轉入大腸桿菌中，獲得具備基底SalIM表達的重組菌，保護基因組DNA不被SalI內切酶切割，使大腸桿菌能夠繼續正常生長增殖，從而提高SalI的表達量。三、制作成具備基底SalIM表達的重組菌感受態細胞；四、將融合了純化標簽的SalI蛋白表達質粒轉入具備基底SalIM表達的重組菌感受態細胞中，獲得陽性單克隆，培養進行SalI限制性內切酶的表達；五、SalI限制性內切酶的純化。

技術領域

本發明涉及分子生物學和細胞工程領域，特別涉及一種SalI限制性內切酶的制備方法。

背景技術

SalI是白色鏈霉菌G(Streptomyces albus G)體內的一種二型限制性內切酶，其特點在于它特異性的識別雙鏈DNA中的GTCGAC并分別在雙鏈5’端之后第一個G殘基進行切割(如圖1所示)。切割后的片段具有黏性末端，是遺傳及基因工程上實用性較高的限制酶種類。

傳統蛋白表達方法將SalI表達的構建質粒直接轉入大腸桿菌中進行表達。但是，作為一種限制性核酸內切酶，其在大腸桿菌內的重組表達會嚴重抑制宿主菌基因組復制，其基底表達會導致克隆菌種無法正常增殖。因此，難以拿到大量的SalI蛋白。目前尚無國內外文獻介紹SalI的重組表達與純化方法。國際上對于限性內切酶的表達常采用低背景表達菌株表達法如使用BL2(DE3)plysS表達HindIII(Watanabe,N.,Takasaki,Y.,Sato,C.,Ando,S.,and Tanaka,I.(2009)Structures of restriction endonuclease HindIII incomplex with its cognate DNA and divalent cations.Actacrystallographica.Section D,Biological crystallography 65,1326-1333)。

因此，本領域的技術人員致力于開發一種能提高SalI表達量的重組表達與純化方法。

發明內容

有鑒于現有技術的上述缺陷，本發明所要解決的技術問題是如何提高SalI蛋白在原核表達菌株中的表達量。

為實現上述目的，本發明的一個方面提供了一種SalI限制性內切酶的制備方法，在原核表達菌株中同時表達SalI和SalIM。可選地，SalI和SalIM改造去除了序列中的SalI酶切位點。

進一步地，SalIM的DNA及氨基酸序列如SEQ ID No.1，SEQ ID No.3所示，或者其氨基酸序列與SEQ ID No.3具有至少95％及以上的相似性；所述SalI的DNA及氨基酸序列如SEQ ID No.2，SEQ ID No.4所示，或者其氨基酸序列與SEQ ID No.4具有至少95％及以上的相似性。

進一步地，原核表達菌株包括大腸桿菌。可選地，原核表達菌株為大腸桿菌BL21(DE3)。

進一步地，該方法包括：先在所述原核表達菌株中轉化入含有SalIM的重組質粒，使得原核表達菌株進行SalIM表達并進行基因組保護修飾；然后在含有SalIM的重組質粒的原核表達菌株中進一步轉化入含有SalI的重組質粒，獲得含有SalIM的重組質粒和含有SalI的重組質粒的原核表達菌株。

進一步地，將含有SalIM的重組質粒的原核表達菌株制備成感受態細胞，并在所述感受態細胞中轉化入含有SalI的重組質粒。

進一步地，含有SalIM的重組質粒不含純化標簽，含有SalI的重組質粒帶有純化標簽。進一步地，純化標簽選自MBP、GST或6*HIS。