[發明專利]用于序列特異性蛋白酶檢測的分子開關

有效

• 申請號: 202110016941.4
• 申請日: 2021-01-05
• 公開（公告）號: CN112831479B
• 公開（公告）日: 2022-10-25
• 發明（設計）人: 胡接力;黃愛龍;李杰
• 申請（專利權）人: 重慶醫科大學
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C07K19/00;C12N5/10;C12Q1/37
• 代理公司: 成都高遠知識產權代理事務所(普通合伙) 51222
• 代理人: 李高峽;張娟

本發明公開了用于序列特異性蛋白酶檢測的分子開關，屬于蛋白檢測領域。本發明的分子開關包括依次用接頭連接的HiBiT突變體、LgBiT和SmBiT；HiBiT突變體和LgBiT之間的接頭含有識別切割序列。前述HiBiT突變體對LgBiT具有高度親和力，但其與LgBiT結合狀態下無熒光素酶功能，因此所述分子開關可以在未接觸蛋白酶時無熒光素酶活性，但接觸蛋白酶時，HiBiT突變體脫離，LgBiT結合SmBiT產生熒光素酶活性，可通過發光底物檢測。本發明的分子開關可提高檢測信噪比，具有比現有分子開關更強的檢測靈敏度。

技術領域

本發明屬于蛋白檢測領域。

背景技術

序列特異性蛋白酶能特異性識別和切割特定的氨基酸序列，在細胞生理、病理過程中有重要作用，在基因工程中也有廣泛應用。比如，煙草蝕斑病毒蛋白酶(Tobacco etchvirus protease,TEVp)和半胱氨酸依賴性天冬氨酸蛋白酶(caspases)就是典型的序列特異性蛋白酶。

TEVp是基因工程中常用的工具酶，具有很強的位點特異性，其特異性識別序列為E-Xaa-Xaa-Y-Xaa-Q-G/S，其中ENLYFQG是最常用的識別序列，切割位點在最后兩個氨基酸之間。TEVp通常被用于體內、體外切割融合蛋白中的標簽蛋白和目的蛋白，還可用于監測蛋白質之間的相互作用、檢測蛋白的結構和功能、用于原核細胞核糖體開關的監測及生化反應的體外檢測等等。

caspases是細胞凋亡等過程中的信號分子和效應分子。當細胞受到諸如DNA損傷、癌基因表達等刺激后，即可觸發內源性或外源性凋亡通路。這些通路中的上游分子如caspase-8，caspase-9等首先被激活，進而導致下游的效應分子caspase-3和其他分子的激活。這些激活的效應分子，切割其底物分子，再通過一系列級聯反應導致凋亡。眾多疾病，如腫瘤、炎癥、感染等，都與caspases有著密切關系，因此caspases長期是生物醫學研究中的重要目標分子。

序列特異性蛋白酶的檢測可以用免疫識別相關的檢測手段，例如Western Blot、酶聯免疫吸附試驗、放射免疫吸附試驗等蛋白通用檢測手段，但通用檢測手段不能檢測酶活，因此，又產生了比色法、熒光共振能量轉移法、雙光子納米探針等等方法，均是利用蛋白酶的特異性識別位點對模擬肽進行切割，使其產生可檢測的熒光(顏色)變化。但這些方法均存在信噪比低的問題。

Nanoluc熒光素酶是從一種深海蝦類動物中分離到的熒光素酶，經過改造和優化后，具有迄今最強的發光活性(96孔板測量值可達10⁸)，同時發光持續時間長，分子量小，這些特點十分有利于其在生物醫學中的應用。此外，Dixon等2015年的研究發現，Nanoluc羧基末端長度為11個氨基酸(AA)的片段，可以與氨基末端的大片段(商品名LgBiT)分離開來。他們將這11AA片段進一步改造和進化，得到兩個新的多肽，商品名稱分別為SmBiT和HiBiT(Promega)。HiBiT與LgBiT之間具有高親和力(Kd＝0.7nM)，而SmBiT與LgBiT之間的親和力很低(Kd＝190μM)，當HiBiT或SmBiT與LgBiT分離時，各部分均沒有酶活性，而當這兩部分靠近時，則恢復Nanoluc活性。

Triana等為了研究2個目標蛋白是否相互作用，將2個目標蛋白分別融合到SmBiT和LgBiT，當熒光素酶活性被激活時，表明這2個目標蛋白存在相互作用關系。Boursier等將HiBiT與G蛋白偶聯受體(GPCR)融合表達于細胞膜，借此可檢測膜表面受體密度；他們還利用了GPCR配體與熒光標志物都競爭性結合HiBiT-GPCR融合蛋白，以評估配體濃度。

目前，尚未見將Nanoluc熒光素酶的不同片段用于檢測序列特異性蛋白酶的報道。

發明內容

本發明要解決的問題是：使用Nanoluc熒光素酶的不同片段來提高序列特異性蛋白酶檢測的信噪比。

本發明的技術方案如下：