[發明專利]用于抗體檢測的多功能蛋白分子開關

有效

• 申請號: 202110016645.4
• 申請日: 2021-01-05
• 公開（公告）號: CN112694535B
• 公開（公告）日: 2023-03-31
• 發明（設計）人: 胡接力;黃愛龍;李杰
• 申請（專利權）人: 重慶醫科大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N9/02;G01N33/68;G01N33/569;G01N33/58
• 代理公司: 成都高遠知識產權代理事務所(普通合伙) 51222
• 代理人: 李高峽;張娟

本發明公開了一種用于抗體檢測的多功能蛋白分子開關，屬于蛋白檢測領域，所述分子開關為融合蛋白，從N端到C端，包括依次連接的如下部分：(1)SmBiT；(2)抗原表位多肽，可被待檢測抗體特異性結合；(3)LgBiT。本發明的分子開關可通過抗原表位多肽與抗體特異性識別，影響SmBiT和LgBiT的結合，極大改變熒光素酶活性，導致前后熒光素酶活性變化，該變化可反映抗體濃度的高低。將本發明的分子開關用于檢測新冠病毒，準確性和特異性均接近100％，具有十分良好的應用價值。

技術領域

本發明屬于蛋白檢測領域。

背景技術

蛋白分子開關是一種可用于檢測各種目標生物分子的生物傳感器，其原理是利用經過特別設計的蛋白分子，在結合目標分子前后的不同構象和功能狀態，來“感知”和反映目標分子的存在，從而達到檢測目的。蛋白分子開關在疾病診斷、生物醫學基礎研究方面有廣泛用途。蛋白分子開關設計的最新進展，以2020年度科學突破獎得主David Baker的工作為代表。他們設計構建了一種人工合成的蛋白分子開關LOCKR(Naure，2019)，然后將該系統用于生物信號調控(Nature，2019)，新近又用于新冠病毒抗體和抗原檢測(BioRxiv，2020)。

變構調節酶常被用來作為分子開關的設計基礎，用于檢測各種蛋白分子，包括針對病毒產生的抗體等。這里的變構調節酶，是指那些酶活性會因為某些構象變化而發生改變的酶。當目標分子尚未結合到酶分子時，酶分子處于活性較低(或較高)的狀態，當目標分子結合到酶分子以后，改變了酶分子的空間結構，從而使酶活性發生變化(變高或者變低)。此時，酶活性的變化即可反映目標分子的存在及其數量。利用變構調節酶檢測目標分子的好處，是目標分子的結合與信號輸出發生在同一個分子上，二者的緊密偶聯有助于保證檢測的高度特異性，因而可以去除反復洗滌和更換緩沖液等諸多步驟，極大簡化檢測流程。利用相似的原理，熒光蛋白也常用于分子開關設計，只不過此時的輸出信號為熒光而非酶活性。

蛋白分子開關的思想由來已久，但其應用較好的方面主要是檢測小分子，比如利用熒光蛋白、鈣調蛋白(CaM)以及鈣調蛋白結合肽(CaM-BP)構建的分子開關來檢測鈣離子。經過近20年迭代改進，這類分子開關目前已經能達到很好的檢測效果。又如利用β內酰胺酶(BLA)、麥芽糖結合蛋白(MBP)構建的分子開關，可以有效地檢測麥芽糖。然而，與這些小分子相比，用蛋白分子開關檢測生物大分子的效果卻不盡人意。以研究較多的β半乳糖苷酶分子開關為例，源于手足口病病毒(FMDV)或HIV的多肽，分別被重組插入該酶的特定位置構建分子開關，即使經過充分優化，這些分子開關在用于血清樣本檢測時，患者血清與對照血清的信號差別，在最好情況下也沒有超過5倍。前述David Baker等利用合成生物學手段，設計構建的人工分子開關，在分子開關的設計基礎和路徑方面提出了新思路，盡管他們據此設計優化的分子開關(LOCKR)，在檢測新冠病毒S蛋白時表現優良(信噪比14倍)，但在檢測新冠病毒抗體時(純化的多抗)，其信噪比也僅達到2倍。在檢測乙肝病毒抗體時，信噪比最高達到約4倍(未用血清進行測試)。如果將這些分子開關用于真實臨床樣本檢測，其檢測信噪比(陽性樣本與陰性樣本的比值)將會更低，因為臨床樣本的成分更復雜，可變因素和干擾因素更多。總之，較小的信噪比，使得現有的分子開關難以真正用于臨床檢測。

Nanoluc熒光素酶是從一種深海蝦類動物中分離到的熒光素酶，經過改造和優化后，具有迄今最強的發光活性(96孔板測量值可達10⁸)，同時發光持續時間長，分子量小，這些特點十分有利于其在生物醫學中的應用。此外，Dixon等2015年的研究發現，Nanoluc羧基末端長度為11個氨基酸(AA)的片段，可以與氨基末端的大片段(商品名LgBiT)分離開來。他們將這11AA片段進一步改造和進化，得到兩個新的多肽，商品名稱分別為SmBiT和HiBiT(Promega)。HiBiT與LgBiT之間具有高親和力(Kd＝0.7nM)，而SmBiT與LgBiT之間的親和力很低(Kd＝190μM)，當HiBiT或SmBiT與LgBiT分離時，各部分均沒有酶活性，而當HiBiT或SmBiT與LgBiT靠近時，則恢復Nanoluc活性。