[發明專利]一種肺癌基因突變位點的檢測方法及其試劑盒

在審

• 申請號: 202110012620.7
• 申請日: 2021-01-06
• 公開（公告）號: CN112899365A
• 公開（公告）日: 2021-06-04
• 發明（設計）人: 尚午;張毅良
• 申請（專利權）人: 南京普濟生物有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/6851
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明提供一種肺癌基因突變位點的檢測方法及其試劑盒，所述檢測方法包括：首先，制備得到數字PCR混合液，所述數字PCR混合液不包含三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸，所述數字PCR使用的引物包含不少于十三個堿基的核酸序列N；其次，用數字PCR混合液進行PCR擴增反應，得到PCR擴增反應后的產物；最后，根據熒光信號的類型判斷待測樣品中是否含有目標基因的位點突變的DNA模板及其數量和突變豐度。本發明獨特的超多重數字PCR技術大幅提高了腫瘤基因檢測的信息通量，可以在2個反應體系內擴增多達99重位點，避免了由于樣本分管造成的靈敏度降低的問題，同時檢測位點數的提升使檢測的臨床意義大幅提升。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種肺癌基因突變位點的檢測方法及其試劑盒。

背景技術

傳統的PCR技術手段容易產生非特異性擴增。為了避免非特異性擴增對結果信噪比和特異性的影響，目前PCR體系內擴增重數限制在10重以內。目前臨床上需要檢測的腫瘤突變位點有近千個，幾乎以NGS平臺為主。目前基于PCR的腫瘤基因檢測產品由于擴增重數的限制，僅覆蓋少量位點，而且需要在多個反應體系內(如艾德生物需使用12個反應體系)完成。多個反應體系內完成檢測導致了對同一患者臨床樣本的稀釋，最終降低了檢測的靈敏度。

因此，有必要提供改進的技術方案以克服現有技術中存在的技術問題。

發明內容

為解決現有技術存在的問題，本發明提供一種肺癌基因突變位點的檢測方法及試劑盒，采用數字PCR的技術手段，應用適應肺癌基因突變位點檢測的緩沖液和引物，進行選定肺癌基因突變位點的檢測。本發明獨特的超多重數字PCR技術大幅提高了腫瘤基因檢測的信息通量，可以在2個反應體系內擴增多達99重位點，避免了由于樣本分管造成的靈敏度降低的問題，同時檢測位點數的提升使檢測的臨床意義大幅提升。

本發明第一方面提供一種肺癌基因突變位點的檢測方法，所述檢測方法包括：

步驟一、制備得到數字PCR混合液；

其中，所述數字PCR混合液不包含三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸，所述數字PCR使用的引物包含三維結構，所述數字PCR使用的引物包含不少于十三個堿基的核酸序列N；所述數字PCR使用的引物包含如下核酸序列：GGGUUGGGAAGAAACUGUGGCACUUCGGUGCCAGCAACCC；

將所述數字PCR使用的引物進行預處理，所述預處理方法包括：將所述數字PCR使用的引物加入到緩沖液中加熱至65～85℃，保溫5～10分鐘，然后冷卻至0～40℃，保溫20～30分鐘；

步驟二、用數字PCR混合液制作PCR微反應單元，再進行PCR擴增反應，得到PCR擴增反應后的產物；

步驟三、對所述PCR擴增反應后的產物進行信號收集，根據熒光信號的類型判斷待測樣品中是否含有目標基因的位點突變的DNA模板及其數量和含量。通過上述技術方案，應用適應肺癌基因突變位點檢測的引物設計，進行選定肺癌基因突變位點的檢測。本發明獨特的超多重數字PCR技術大幅提高了腫瘤基因檢測的信息通量，可以在2個反應體系內擴增多達99重位點，避免了由于樣本分管造成的靈敏度降低的問題，同時檢測位點數的提升使檢測的臨床意義大幅提升。

優選地，在如前所述的檢測方法中，所述緩沖液的組分為：300±5mM NaCl，4.5±1mM MgCl₂，20±5mM Tris(pH 7.6)。通過該技術方案，應用適應肺癌基因突變位點檢測的緩沖液和引物設計，進行選定肺癌基因突變位點的檢測。本發明獨特的超多重數字PCR技術大幅提高了腫瘤基因檢測的信息通量，可以在2個反應體系內擴增多達99重位點，避免了由于樣本分管造成的靈敏度降低的問題，同時檢測位點數的提升使檢測的臨床意義大幅提升。