[發(fā)明專利]一種用于DNA聚合酶識別特異性的緩沖液及其應(yīng)用

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202110007524.3
• 申請日: 2021-01-05
• 公開（公告）號: CN112899353A
• 公開（公告）日: 2021-06-04
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 尚午;王友祥;楊志劼
• 申請（專利權(quán)）人: 南京普濟生物有限公司
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686;C12N9/12
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明提供一種用于DNA聚合酶識別特異性的緩沖液及其應(yīng)用，所述緩沖溶液包括少于四種堿基類型的dNTPs或少于四種堿基類型的dNTPs的類似物、包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的DNA聚合酶。通過本發(fā)明制備的用于DNA聚合酶識別特異性的緩沖液，可支持含有特定三個或三個以下堿基類型的目標(biāo)序列的擴增。當(dāng)目標(biāo)序列中含有第四個堿基時，擴增反應(yīng)將終止，因而可明顯地控制DNA序列擴增過程產(chǎn)生的非特異性擴增。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于DNA聚合酶識別特異性的緩沖液及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

緩沖溶液是指具有能夠維持PH相對穩(wěn)定性能的溶液。在緩沖溶液中，pH值在一定的范圍內(nèi)不因稀釋或外加少量的酸或堿而發(fā)生顯著的變化，緩沖溶液依據(jù)共軛酸堿對及其物質(zhì)的量不同而具有不同的pH值和緩沖容量。在生化研究工作中，常常需要使用緩沖溶液來維持實驗體系的酸堿度。研究工作的溶液體系pH值的變化往往直接影響到DNA聚合酶研究工作的成效。如果DNA聚合酶實驗體系的pH值變動或大幅度變動，酶活性就會下降甚至完全喪失，所以配制緩沖溶液是一個不可或缺的關(guān)鍵步驟。盡管DNA聚合酶的緩沖溶液對于DNA聚合酶的活性發(fā)揮尤其重要，但是，具體到，如何研發(fā)一種特異性識別特定堿基序列的DNA聚合酶的緩沖溶液，能避免DNA聚合酶擴增過程存在的非特異性擴增，在世界范圍內(nèi)還處于一個研究難題。

此外，現(xiàn)有的DNA聚合酶適配的緩沖溶液，在樣本中進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)時，在樣本緩沖溶液中需添加各種dNTPs，才能完成特異性堿基序列識別、擴增或檢測。但是對于一些目標(biāo)序列中含有少于四種堿基的序列的識別過程中，現(xiàn)有的DNA聚合酶普遍存在特異性堿基序列識別的難題，無法有效地擴增出特異性堿基序列。尤為重要的是，現(xiàn)有的DNA聚合酶適配的緩沖溶液，無法完成單一反應(yīng)體系內(nèi)超多重PCR的高效和準(zhǔn)確的擴增。

因此，亟需開發(fā)一種能夠用于特異性堿基序列識別的DNA聚合酶的緩沖液。

發(fā)明內(nèi)容

為解決現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供一種用于DNA聚合酶識別特異性的緩沖液、及其制備方法與應(yīng)用，可支持含有特定三個或三個以下堿基類型的目標(biāo)序列的擴增。當(dāng)目標(biāo)序列中含有第四個堿基時，擴增反應(yīng)將終止。因此，本發(fā)明可明顯地控制DNA序列擴增過程產(chǎn)生的非特異性擴增，支持完成單一反應(yīng)體系內(nèi)超多重PCR的高效和準(zhǔn)確的擴增。

本發(fā)明第一方面提供一種用于DNA聚合酶識別特異性的緩沖溶液，其特征在于，所述緩沖溶液包括少于四種堿基類型的dNTPs或少于四種堿基類型的dNTPs的類似物。通過本技術(shù)方案，可明顯地控制DNA序列擴增過程產(chǎn)生的非特異性擴增。

優(yōu)選地，如前所述的緩沖溶液，包括DNA聚合酶，所述DNA聚合酶包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。通過本技術(shù)方案，可明顯地控制DNA序列擴增過程產(chǎn)生的非特異性擴增，支持完成單一反應(yīng)體系內(nèi)超多重PCR的高效和準(zhǔn)確的擴增。

優(yōu)選地，如前所述的緩沖溶液，包括DNA聚合酶，所述的DNA聚合酶蛋白序列包含在一個或多個位置發(fā)生氨基酸取代的SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；其中，所述一個或多個位置選自SEQ ID No:1所示的氨基酸序列中第6位、第8位、第10位、第104位、第205位或其任意組合。通過本技術(shù)方案，可明顯地控制DNA序列擴增過程產(chǎn)生的非特異性擴增，支持完成單一反應(yīng)體系內(nèi)超多重PCR的高效和準(zhǔn)確的擴增。當(dāng)目標(biāo)序列中含有第四個堿基時，擴增反應(yīng)將終止。因此，本發(fā)明可明顯地控制DNA序列擴增過程產(chǎn)生的非特異性擴增。

優(yōu)選地，如前所述的緩沖溶液包括包括DNA聚合酶，所述的DNA聚合酶蛋白序列包含在多個位置發(fā)生氨基酸取代的SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，其中，所述多個位置選自SEQ ID No:1所示的氨基酸序列中第6位、第8位、第10位、第104位和第205位全部發(fā)生氨基酸取代。通過本技術(shù)方案，可明顯地控制DNA序列擴增過程產(chǎn)生的非特異性擴增，支持完成單一反應(yīng)體系內(nèi)超多重PCR的高效和準(zhǔn)確的擴增。