[發明專利]一種用于重油污染修復的漆酶及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 202110006601.3
• 申請日: 2021-01-05
• 公開（公告）號: CN112813039A
• 公開（公告）日: 2021-05-18
• 發明（設計）人: 代小麗;呂靜
• 申請（專利權）人: 輕工業環境保護研究所;中國石油大學（北京）
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/53;C12N15/70;C12N15/66;A62D3/02;C12R1/19;A62D101/28
• 代理公司: 北京盛凡智榮知識產權代理有限公司 11616
• 代理人: 孫莉莉

本發明適用于石油污染修復技術領域，提供了一種用于重油污染修復的漆酶及其制備方法和應用，該漆酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其制備方法包括以下步驟：特異性擴增漆酶的編碼基因；將擴增產物進行雙酶切后，再連接到雙酶切的克隆質粒上，得到第一重組質粒；將第一重組質粒電轉移到第一菌株上，得到克隆菌株；從克隆菌株中提取第一重組質粒，并對第一重組質粒和表達質粒進行雙酶切后，再將進行連接，得到第二重組質粒；將第二重組質粒電轉化到第二菌株上，得到表達菌株；將表達菌株進行誘導表達培養，得到所述漆酶。本發明所提供的制備方法可顯著提高漆酶分泌速度和漆酶活性，其制備的漆酶可顯著提高重油的生物降解效率和速率。

技術領域

本發明屬于石油污染修復技術領域，尤其涉及一種用于重油污染修復的漆酶及其制備方法和應用。

背景技術

為了滿足全世界不斷增長的能源需求，重油在石油開發利用中所占的比例正逐漸加大，由重油導致的污染事故也呈逐年增長的趨勢。相比常規原油，重質原油具有更高的密度和粘度，以及高分子量碳氫化合物(尤其是難降解的高環多環芳烴)，雜環化合物和高含量的重金屬。由于重油中含有高含量的難生物降解和高生物毒性組分，重油污染一旦發生，將對生態環境和人體健康造成更為嚴重、持久的危害，迫切需要高效的重油污染修復技術。

重油污染的修復技術包括物理修復技術、化學修復技術和生物修復技術三種，其中化學修復技術因可能對生態環境造成比石油污染更為嚴重的損害，且會對環境造成二次污染的缺點而被限制使用。石油污染發生后，通常利用人工除油去除介質表面的石油，而介質表面下的原油有時也會通過物理方法去除，但可能需要投入大量的人工和機械，盡管如此，物理法對埋藏在介質內部和分散儲存的原油并不能徹底的去除。微生物降解是實現石油污染物徹底去除的最主要、最根本的途徑，但由于在物化條件和土著生態等多重壓力下，高效菌群從實驗室轉移到真正的重油污染環境往往需要很長的適應期，導致生物修復的啟動速度緩慢。另外，重油中高含量的難生物降解有機化合物(例如長鏈脂肪烴、稠環芳烴等)也給重油污染的微生物修復帶來了新的挑戰。

漆酶(EC1.10.3.2)是一種高效的多酚氧化酶，在氧分子的參與下，它能夠催化多種PHAs、酚類、芳香胺類等其他富含電子的底物進行單電子氧化，形成醌或低聚物并將氧分子還原成水。將漆酶制劑用于重油污染修復具有可專一性高效降解重油中多環芳烴等污染物，且降解過程不受跨膜運輸的限制，對環境營養要求不高、不易受捕食和有毒物質影響等優勢，將漆酶制劑用于石油污染物修復可以克服重油污染微生物的限制。然而，由于野生菌株受到多種因素的調控，產酶量往往難以達到較高的水平，限制了漆酶制劑的工業化應用。因此，通過基因工程技術克隆漆酶的編碼基因，并使這些基因在異源受體上大量表達具有重要意義。

發明內容

本發明實施例的目的在于提供一種用于重油污染修復的漆酶，旨在解決背景技術中提出的問題。

本發明實施例是這樣實現的，一種用于重油污染修復的漆酶，其其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

作為本發明實施例的一種優選方案，其編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本發明實施例的另一目的在于提供一種含有上述編碼基因的克隆載體。

進一步地，上述克隆載體為將上述編碼基因片段連接至克隆質粒pMD19T上，得到重組克隆質粒pMD19T-Bslac。

本發明實施例的另一目的在于提供一種含有上述重組克隆載體的克隆菌株。

進一步地，將上述重組克隆載體電轉移到克隆菌株E.coli DH5α中，通過LB-Amp平板藍白斑篩選獲得攜帶有pMD19T-Bslac的克隆菌株E.coli DH5α。

本發明實施例的另一目的在于提供一種含有上述編碼基因的表達載體。

進一步地，上述表達載體為將上述編碼漆酶的編碼基因片段連接至表達質粒pET28a上，得到重組表達質粒pET28a-Bslac。