[發(fā)明專利]一種用于重油污染修復的漆酶及其制備方法和應用

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202110006601.3
• 申請日: 2021-01-05
• 公開（公告）號: CN112813039A
• 公開（公告）日: 2021-05-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 代小麗;呂靜
• 申請（專利權(quán)）人: 輕工業(yè)環(huán)境保護研究所;中國石油大學（北京）
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/53;C12N15/70;C12N15/66;A62D3/02;C12R1/19;A62D101/28
• 代理公司: 北京盛凡智榮知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11616
• 代理人: 孫莉莉

1.一種用于重油污染修復的漆酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于重油污染修復的漆酶，其特征在于，其編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.一種如權(quán)利要求1或2所述用于重油污染修復的漆酶的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

特異性擴增漆酶的編碼基因，得到擴增產(chǎn)物；

將擴增產(chǎn)物進行雙酶切后，再連接到同樣經(jīng)雙酶切的克隆質(zhì)粒上，得到第一重組質(zhì)粒；

將第一重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)移到第一菌株上，并經(jīng)篩選，得到克隆菌株；

從克隆菌株中提取第一重組質(zhì)粒，并對第一重組質(zhì)粒和表達質(zhì)粒進行雙酶切處理后，再將二者的酶切產(chǎn)區(qū)連接，得到第二重組質(zhì)粒；

將第二重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化到第二菌株上，并經(jīng)篩選，得到表達菌株；

將表達菌株進行誘導表達培養(yǎng)，得到所述漆酶。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種用于重油污染修復的漆酶的制備方法，其特征在于，所述特異性擴增漆酶的編碼基因，得到擴增產(chǎn)物的步驟，具體包括：

以枯草芽孢桿菌的Bacillus subtilis subsp.subtilis str.168基因組DNA為模板，利用特異性引物進行PCR擴增，得到擴增產(chǎn)物。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種用于重油污染修復的漆酶的制備方法，其特征在于，所述特異性引物攜帶限制性酶切位點EcoR I和BamH I，其包括：

上游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

下游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種用于重油污染修復的漆酶的制備方法，其特征在于，所述克隆質(zhì)粒為pMD19T，所述第一菌株為E.coli DH5α，所述表達質(zhì)粒為pET28a，所述第二菌株為E.coli BL21(DE3)。

7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種用于重油污染修復的漆酶的制備方法，其特征在于，所述將表達菌株進行誘導表達培養(yǎng)，得到所述漆酶的步驟，具體包括：

將表達菌株劃線到LB-Kan平板上進行培養(yǎng)后，挑取單菌落于液體LB-Kan中進行培養(yǎng)，得到培養(yǎng)液；

將培養(yǎng)液接種于LB培養(yǎng)液中繼續(xù)進行培養(yǎng)至預設(shè)的OD₆₀₀值后，再加入誘導劑進行誘導表達，收集得到菌體；

往菌體中加入細胞裂解液，并置于冰上進行超聲波破碎至菌液澄清時結(jié)束，得到含有所述漆酶的粗酶液。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種用于重油污染修復的漆酶的制備方法，其特征在于，所述步驟中，預設(shè)的OD₆₀₀值為0.4～0.8。

9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種用于重油污染修復的漆酶的制備方法，其特征在于，所述誘導劑為異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)。

10.一種如權(quán)利要求1或2所述的漆酶在石油污染修復中應用。