[發明專利]一種囊泡離心保護劑及其應用和離心提取囊泡的方法

有效

• 申請號: 202110005298.5
• 申請日: 2021-01-05
• 公開（公告）號: CN112680397B
• 公開（公告）日: 2023-03-21
• 發明（設計）人: 童雅琪;陳彬;張一
• 申請（專利權）人: 湖北盛齊安生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12N5/00
• 分類號: C12N5/00
• 代理公司: 北京隆源天恒知識產權代理有限公司 11473
• 代理人: 吳航

本發明提供了一種囊泡離心保護劑及其應用和離心提取囊泡的方法，屬于生物技術領域。所述囊泡離心保護劑包括甘油和羧甲基纖維素鈉。本發明在差速離心的基礎上，采用甘油與羧甲基纖維素鈉作為離心保護劑，甘油可滲透進入胞內以提高胞內溶液的溶質濃度，而羧甲基纖維素鈉則在胞外以提高胞外溶液的溶質濃度，進而實現囊泡內外的滲透壓平衡，有利于提高其抗擠壓變形能力，最大限度地保護囊泡在超高速離心過程中不受損傷，提高囊泡產率。而且，羧甲基纖維素鈉的加入可改變囊泡表面荷電性，破壞其靜電斥力，引起相鄰囊泡聚集沉淀，提高囊泡沉降速度，縮短提取所需時間，進一步提高囊泡產率和分離效率。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，特別涉及一種囊泡離心保護劑和該囊泡離心保護劑在離心提取囊泡中的應用，還涉及離心提取囊泡的方法。

背景技術

細胞骨架是真核細胞借以維持其基本形態的重要結構，細胞在受到外源性或內源性刺激之后會引起細胞骨架發生重排，導致細胞膜局部受力不均勻。受力異常的胞質會向胞外膨脹，進而隨機包裹部分細胞內容物后以囊泡的形式釋放到細胞外部，這種直徑約為0.1-1μm的特殊亞細胞結構稱為“細胞囊泡”。細胞囊泡由于攜帶有原細胞的生物標記分子，可以被目標細胞特異性識別，越來越多的研究者開始采用腫瘤細胞來源的細胞囊泡作為新一代的藥物遞送系統，以達到靶向給藥、降低生物屏障、提高生物相容性等諸多優勢，進而增強化療藥物的治療效果。因此，細胞囊泡在藥物載體領域具有廣泛的應用前景。而獲得性質穩定、純度高的細胞囊泡是開展上述研究工作的先決條件。

目前，細胞囊泡的提取純化主要是采用超速離心法或梯度密度離心法、透析法、超濾法、凝膠排阻色譜法和免疫磁珠法。離心法是基于細胞囊泡與其它生物組分密度的沉降速率差異進行分離，操作簡單，但由于細胞囊泡的體積小、質量輕，往往需要較高的離心力和較長的離心時間才能沉降細胞囊泡，同時長時間高速離心對囊泡數量影響較大，易導致細胞囊泡受壓破裂和結塊，從而造成細胞囊泡損失，導致產率低下影響后續實驗。透析法和超濾法均是根據截留分子量將細胞囊泡與雜質分離開，區別在于：透析法是利用細胞囊泡不能透過半透膜而進行純化的一種方法，其分離提取全過程所需時間較長，囊泡回收效率低下；而超濾法是以超濾膜兩側的壓力差為驅動力，以超濾膜為過濾介質，利用細胞囊泡不能穿過超濾膜而除去雜質的一種方法，其純化效率大大提高，但囊泡損失量大，且雜質容易堵塞濾膜，當濾膜發生破損時會導致細胞囊泡大量損失，回收率低。凝膠排阻色譜法是基于細胞囊泡與溶液中與其它生物組分的尺寸差異，利用不同尺寸組分在凝膠色譜柱中遷移速度的差異將細胞囊泡與其它組分分離開來，得到純度較高的細胞囊泡，但此法耗時較長，并且分離過程中細胞囊泡或其它組分易吸附色譜柱的空隙中，造成阻塞，影響分離效率。免疫磁珠法是利用細胞囊泡表面的特異性蛋白如：CD9/CD63/CD81等與包被有對應抗體的免疫磁珠相結合，進行磁分離，但由于免疫磁珠體積較小，粒徑為納米級別且小于等于細胞囊泡的直徑，因此與細胞囊泡結合的空間位阻較大，分離效率不高，且由于抗體價格較為昂貴，導致此法的分離成本較高；此外，采用免疫磁珠法分離獲得的細胞囊泡因為洗脫時使用酸性洗脫液進行洗脫，易導致細胞囊泡形態不完整，影響其下游的應用。此外，還有基于親水性聚合物沉淀的方法提取細胞囊泡，但分離到的細胞囊泡中通常摻雜很多雜蛋白成分，細胞囊泡純度和產率極低，不適用對純度要求較高的應用場景。

發明內容

針對以上現有技術中細胞囊泡分離效率和產率低的問題，本發明提供了一種囊泡離心保護劑和該囊泡離心保護劑在離心提取囊泡中的應用，以及離心提取囊泡的方法。

為實現上述目的，本發明具體通過以下技術方案實現：

一種囊泡離心保護劑，包括甘油和羧甲基纖維素鈉。

進一步地，所述囊泡離心保護劑包括3％wt-7％wt甘油和2％wt-8％wt羧甲基纖維素鈉。

進一步地，所述囊泡離心保護劑包括5％wt甘油和4％wt羧甲基纖維素鈉。

進一步地，所述囊泡為細胞囊泡或載藥囊泡。