[發明專利]用于將多核苷酸遞送至外泌體中的核酸構建體

在審

• 申請號: 202080088271.0
• 申請日: 2020-12-18
• 公開（公告）號: CN114867855A
• 公開（公告）日: 2022-08-05
• 發明（設計）人: 倫道夫·科特林;魯本·多格拉西亞斯
• 申請（專利權）人: 蘭諾龍有限公司
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11
• 代理公司: 上海旭誠知識產權代理有限公司 31220
• 代理人: 鄭立;周素霞

本發明使用在miRNA分子MIR21、pri?miR?21和pre?miR?21中鑒定的結構和調控特性將外源核苷酸序列遞送至外泌體中。特別地，本發明涉及用于將外源核苷酸序列靶向到外泌體的pre?miRNA，其中pre?miRNA包含外源核苷酸序列和莖環結構，其中莖包含至少一個擺動對。本發明還提供包含工程化的pre?miRNA的核酸盒、載體和細胞、裝載外泌體的方法和所得裝載的外泌體。裝載的外泌體能夠用于將外源核苷酸序列遞送至靶細胞，例如在療法中。

技術領域

本發明涉及能夠將核苷酸序列遞送至外泌體中的核酸構建體，以及使用這些構建體產生包含感興趣的核苷酸序列的外泌體的方法。

背景技術

外泌體是起源于內體區室的膜結合囊泡，并且當多囊體(MVB)與質膜融合時從細胞中分泌出來。外泌體的直徑典型地在30和120nm之間。外泌體可含有許多類型的生物分子，包括蛋白、碳水化合物、脂質和核酸。外泌體生物發生涉及膽固醇、神經酰胺和其它脂質在膜上的富集，這些脂質典型地存在于抗去污劑的細胞膜中。蛋白也嵌入外泌體膜中，諸如跨膜四蛋白和其它跨膜蛋白和受體，它們可在它們的分選和生物活性中發揮作用(Colombo等人，2014年)。

外泌體的內腔含有特定的蛋白和核酸，諸如microRNA(miRNA)，它們賦予外泌體調制靶細胞中轉錄和翻譯的能力。外泌體內的miRNA庫似乎反映生產細胞的生理狀態，選擇的miRNA穿梭到外泌體中。還觀察到外泌體包裹或外泌體相關聯的miRNA的分泌在影響產生它們的細胞的旁分泌活動中發揮作用。這種機制可使細胞在正常條件下和對局部刺激(諸如感染、營養缺乏或缺氧)的反應中均進行局部和遠程控制。

將外源貨物分子諸如感興趣的miRNA裝載到外泌體中被認為是利用它們在細胞間遞送信號的能力的有用方法。一種方法是將感興趣的生物分子直接引入收獲的外泌體。然而，盡管使用諸如電穿孔和脂質體轉染的技術在小規模上可能實現這一點，但這些技術尚未被證明在大規模上是可重復的、可擴展的或可靠的。此外，這些技術甚至可損害外泌體的結構(Janas等人，2015年)。

已經證明miRNA被細胞選擇性地穿梭到外泌體中。約60％的miRNA編碼序列位于基因內或基因間區，并且因此表達取決于調控一級基因表達的調控序列和轉錄因子。然而，較小比例的miRNA編碼區位于基因間區，并且含有它們自己的啟動子序列、增強子和阻遏子。因此，這些miRNA的表達取決于附加的調控水平，以細胞依賴性和刺激依賴性的方式特異性地控制它們的正確表達，這種方式依賴于由其它基因管控的啟動子介導的激活。在這兩種情況下，miRNA最初被轉錄嵌入稱為pri-miRNA(“一級miRNA”)的長前體內，其中功能性miRNA被含有酶Drosha的蛋白復合物對其有效和正確加工和切割所必需的序列圍繞。Drosha在細胞核中的正確加工形成被稱為pre-miRNA的較短前體。這種pre-miRNA典型地形成莖環結構，然后從細胞核轉運到細胞質，在細胞質中它被蛋白復合物RISC識別，RISC包括RNase DICER和Argonaute(Ago)蛋白。Dicer切割pre-miRNA結構的環部分以形成成熟雙鏈miRNA，其中一條鏈(稱為過客鏈)可能被Ago降解或丟棄，在RISC內留下單鏈指導鏈。然后，RISC復合物能夠沉默包含與單鏈miRNA指導鏈互補的序列的信使RNA的基因表達。pre-miRNA中發夾的長度和環的大小被認為對于DICER的正確切割和指導miRNA鏈的定位均是至關重要的(Tsutsumi等人，2011年)。

目前，尚不清楚穿梭到外泌體中的miRNA如何在產生外泌體的細胞中逃避RISC的細胞質加工。Ago蛋白一般不位于外泌體中，這表明將miRNA分選為外泌體的特定機制。已經證明，將miRNA向上穿梭到外泌體中需要pre-miRNA或成熟miRNA與一組不同的RNA結合蛋白(RBP)相互作用，這些RNA結合蛋白對MVB形成期間位于內質膜中的神經酰胺具有高親和力(Villarroya-Beltrei等人，2013年)。然而，不同的細胞和microRNA組合報告不同的RBP作為伴侶。關于哪一種RBP負責miRNA選擇性穿梭到外泌體中，似乎沒有達成共識，而且似乎在細胞之間采用不同的RBP。