[發明專利]純化方法

在審

• 申請號: 202080014339.0
• 申請日: 2020-02-14
• 公開（公告）號: CN113423832A
• 公開（公告）日: 2021-09-21
• 發明（設計）人: 喬爾喬斯·派特索斯
• 申請（專利權）人: 雷沃盧金有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 中科專利商標代理有限責任公司 11021
• 代理人: 柴云峰;張瑩

描述了從樣品分離核酸的濾器和從樣品分離并純化核酸的方法。濾器具有第一多孔區域和第二多孔區域。第一多孔區域設置成使用時與第二多孔區域之前的樣品接觸，并且第一多孔區域具有大于第二多孔區域的標稱孔徑。

發明領域

本發明涉及從樣品分離核酸的濾器。本發明還涉及從樣品分離核酸的方法、純化從樣品分離的核酸的方法和從樣品分離核酸的試劑盒。

背景

分離包含來自生物樣品(例如細胞)的DNA的純的、完好核酸在眾多領域至關重要。

例如，來自患者的含細胞臨床樣品可以經歷某種程序(包括細胞裂解步驟)以分離包含DNA的核酸，后者隨后經本領域熟知的程序分析。這種分析可以例如旨在鑒定來自特定微生物(例如細菌)的DNA(以確定患者是否已經被該微生物感染)或可以例如旨在確定患者的DNA是否具有一個或多個造成某醫學病狀的點突變。

已知的DNA分離方法通常至少包括以下步驟：

(a)用緩沖的裂解組合物裂解含細胞的樣品；

(b)將(a)的樣品與濃鹽溶液混合；

(c)來自(b)的樣品與醇(例如甲醇、乙醇或異丙醇)混合；

(d)使所得到的混合物與固相支持物(即濾器)接觸，以固定來自已裂解材料的DNA；

(e)用含有醇的洗滌液洗滌支持物；并且

(f)洗脫DNA。

這類已知的分離方法經常導致提取相對短的DNA片段，例如小于50,000堿基對(bp)的片段。這些片段隨后可以通過短讀段測序技術(例如Illumina銷售的那些技術)或如Oxford Nanopore Technologies(ONT)提供的長讀段測序技術來測序，例如MinION、GridION X5、PromethION上運行的流動小室等或Sequel System上運行的PacificBiosciences(Pacbio)單分子實時(SMRT)。短讀段測序技術適于相對短的DNA片段(如100至500bp)的代碼測序。這些序列隨后用來基于重疊序列片段構建基因組。但是，在許多情況下這種類型的技術不能用來破譯重復序列或重組染色體區段的代碼。該技術經常還可以用來確定比對的序列是否源自相同的鏈(染色體)或細胞，或構建的基因組是否另由來自不同鏈和細胞的小讀段構成。

長讀段測序技術可以讀取數十個或成千上萬個堿基長的序列并且可以用來證明序列衍生自同一條鏈。在一個有臨床意義的實例中，長讀段測序法用來成功地定位BCR-ABL1融合基因轉錄物上的突變。這些類型的突變使慢性髓細胞性白血病(CML)患者抵抗酪氨酸激酶抑制劑(TKI)療法，并且因此重要的是表征、篩選和研究那些導致耐藥的突變。歸因于基因靶上使用約1,600bp的長讀段(比短讀段技術的100至500bp讀段大得多)，已經可能鑒定相同鏈上存在的突變并且將它們與其他鏈或其他轉錄物同工型上存在的隨機改變區分。這還提供關于CML突變克隆性分布的信息。這些結果可以訓練向患者施用哪種療法的決策(Cavalier等人,2015)。

許多長讀段技術需要平均100千堿基(kb)或較長的長DNA。甚至隨后，長讀段技術傾向于偏好讀取較小的DNA片段(10kb以下)，若這類片段存在于含較長片段的樣品中。這可能導致測序錯誤及序列作圖難題。偏好短DNA片段還可能使得瞄準或讀取復雜基因組(如人類基因組)的基因更困難。

然而，可能難以獲得1)含有適于測序的長DNA片段和2)不含有或具有減少量的較短DNA片段的優質DNA。

影響給定方法提供含具體核酸的給定樣品的能力的因素包括固相支持物(即濾器)保留所需核酸的能力，并且還包括一旦捕獲，使用者從固相支持物/濾器取下(即通過從濾器/柱洗脫)相關的已捕獲核酸的能力。