[發明專利]一種重組人源III型膠原蛋白及其畢赤酵母重組表達系統

有效

• 申請號: 202011638901.5
• 申請日: 2020-12-31
• 公開（公告）號: CN112552393B
• 公開（公告）日: 2022-02-01
• 發明（設計）人: 楊鷺;黃文濤
• 申請（專利權）人: 西安德諾海思醫療科技有限公司
• 主分類號: C07K14/78
• 分類號: C07K14/78;C12N15/81;C12N15/12;C12N1/19;A61L27/24;A61K8/65;A61Q19/00;C12R1/84
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責任公司 61200
• 代理人: 范巍

本發明公開了一種重組人源III型膠原蛋白及其畢赤酵母重組表達系統。本發明將人源III型膠原蛋白部分肽段中含有纈氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸的Gly?X?Y結構肽以使用頻率較高的不含上述氨基酸的Gly?X?Y結構肽替換，根據替換后肽段獲得編碼肽段的基因序列，然后構建用于串聯表達不同重復數目肽段的基因表達載體并轉化畢赤酵母宿主菌，篩選獲得高表達重組人源III型膠原蛋白的菌株。本發明通過蛋白結構的人工設計優化，有效解決天然膠原在發酵中發生降解的問題，表達產物穩定性高、生物相容性好，可用于大規模生產。

技術領域

本發明屬于基因工程領域，具體涉及利用畢赤酵母表達重組人源III型膠原蛋白。

背景技術

膠原蛋白(collagen)是體內含量最多的一種蛋白質，是細胞外基質(ECM)的主要成分，其對維護細胞、組織、器官的正常生理功能和損傷修復具有重要作用，已廣泛應用于醫藥、保健品及化妝品行業中。在分子結構上，每條膠原肽鏈主要由Gly-X-Y結構肽構成(X、Y是Gly之外的任何氨基酸殘基)，這種肽鏈結構是形成膠原纖維高級結構所必需的，決定了膠原蛋白優良的生物相容性和低免疫原性。

膠原蛋白的主要來源是從動物組織中提取，而隨著生物技術的發展，利用基因重組技術，通過微生物發酵法獲得重組膠原蛋白，解決了傳統提取法存在的病毒隱患，同時與天然膠原蛋白相比，人工設計的重組膠原蛋白的親水性和生物相容性顯著提高。但研究表明利用重組菌株，例如，畢赤酵母基因工程菌表達膠原蛋白時，在發酵過程中重組菌株表達的膠原蛋白會出現明顯的降解現象，不利于后續的純化及應用，同時也提高了膠原蛋白的生產消耗和成本。

中國專利CN111647089A公開了一種重組類人彈性蛋白及其組合物，通過短重復氨基酸序列串聯(重復3～7次)構成目的蛋白多肽序列，具有較好的耐降解性能，催化活性較單一原始片段保持更久。但是短重復氨基酸序列串聯導致重組蛋白與天然蛋白序列同源性降低，并不適合作為與生物體長期接觸的生物材料進行應用。

中國專利CN109680025A公開了一種提高重組人源膠原蛋白生產水平且降低蛋白降解速度的發酵工藝，其在甲醇誘導培養階段(90～120小時)向發酵培養基中加入檸檬酸銨，可以提高重組人源膠原蛋白的生物合成速率，縮短發酵時間，同時也提高了重組人源膠原蛋白在發酵液中的穩定性。但隨著重組人源蛋白與發酵液分離，仍無法解決重組人源膠原蛋白在下游純化過程及應用過程中的穩定性問題。

中國專利CN103102407A中提供了一種酵母基因工程菌，其可以表達帶有特異性親和純化標記和兩段相同的人源III型膠原蛋白片段的基因重組類人膠原蛋白。該專利采用與天然膠原的部分肽段序列完全相同的兩段序列(通過EFT連接)構建重組蛋白，但從結果電泳圖中可以看出目的蛋白附近有明顯的降解片段。同時，雖然使用特異性純化標記可獲得純度較高的目的蛋白，但純化標記會影響蛋白的免疫原性，從而影響蛋白的應用。

發明內容

本發明的目的在于提供一種重組人源III型膠原蛋白及其畢赤酵母重組表達系統。

為實現上述目的，本發明采用了以下技術方案：

一種重組人源III型膠原蛋白，該重組人源III型膠原蛋白包括重復串聯的單體，所述單體為突變的人源III型膠原蛋白氨基酸序列片段，單體的突變位點為人源III型膠原蛋白氨基酸序列片段中含有纈氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸或丙氨酸的Gly-X-Y結構肽(三肽重復序列)。

優選的，所述單體為由50～500個氨基酸構成的肽段，突變的Gly-X-Y結構肽數與單體的Gly-X-Y結構肽總數的數量比為小于10％(例如，2％～8％)。