[發明專利]胰島素受體蛋白表達細胞株及其應用

在審

• 申請號: 202011632372.8
• 申請日: 2020-12-31
• 公開（公告）號: CN114686437A
• 公開（公告）日: 2022-07-01
• 發明（設計）人: 張貴民;劉忠;趙麗麗;朱中松;魏永永;馬魯南;曹宇
• 申請（專利權）人: 魯南制藥集團股份有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/85;C12N15/12;G01N33/74;C12R1/91
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• 代理人: 暫無信息

本發明屬于藥物生物活性檢測技術領域，具體涉及一種胰島素受體蛋白的基因工程細胞株的建立，以及基于此細胞株受到胰島素刺激后胰島素受體磷酸化水平的變化來測定胰島素生物活性的檢測方法。具體地，本發明所述的表達INSR蛋白的細胞株為CHO?K1?INSR?6B3，胰島素同胰島素受體結合后，胰島素受體磷酸化，胰島素的活性和磷酸化受體的量，存在量效關系，通過檢測胰島素受體的磷酸化水平，可以定量的檢測胰島素的活性。該檢測方法易標準化，重復性好，具有成本低、方便、準確的特點，因而具有良好的應用前景。

技術領域

本發明屬于藥物生物活性檢測技術領域，具體涉及一種胰島素受體蛋白的基因工程細胞株的建立，以及基于此細胞株受到胰島素刺激后胰島素受體磷酸化水平的變化來測定胰島素生物活性的檢測方法。

背景技術

胰島素于1921年由加拿大人F.G.班廷和C.H.貝斯特首先發現。1922年開始用于臨床，使過去不治的糖尿病患者得到挽救。中國科學院腎病檢測研究所主治直至80年代初，用于臨床的胰島素幾乎都是從豬、牛胰臟中提取的。人胰島素由A、B兩個肽鏈組成，A鏈有11種21個氨基酸，B鏈有15種30個氨基酸，共16種51個氨基酸組成。其中A7(Cys)-B7(Cys)、 A20(Cys)-B19(Cys)四個半胱氨酸中的巰基形成兩個二硫鍵，使A、B兩鏈連接起來。此外A 鏈中A6(Cys)與A11(Cys)之間也存在一個二硫鍵。

1955年英國F.桑格小組測定了牛胰島素的全部氨基酸序列，開辟了人類認識蛋白質分子化學結構的道路。我國科學家王應睞、鄒承魯等人于1958年開始探索用化學方法合成胰島素。1965年9月，我國學者完成了結晶牛胰島素的全合成，成為世界上第一個人工合成的蛋白質。1982年以后，世界上第一支人工基因合成的大腸桿菌重組人胰島素(優泌林)推出，酵母菌重組的人胰島素隨后相繼上市，廣泛用于糖尿病治療，隨后，甘精胰島素、地特胰島素、門冬胰島素及胰島素的類似物相繼上市，開創了糖尿病胰島素治療的新紀元。

人類胰島素受體(IR)是一個(αβ)2同型二聚體受體酪氨酸激酶,在葡萄糖體內平衡和調節脂質，蛋白質，碳水化合物代謝中扮演一個關鍵的角色。IR信號也調節腦神經遞質水平，異常的IR信號與2型糖尿病、癌癥和阿爾茨海默病有關。細胞外的部分紅外αβ單體包括兩個富亮氨酸重復域(L1和L2)半胱氨酸富集區域(CR)和三個纖連蛋白類型III域，插入域 (ID)位于FnIII-2和包含αβ亞基蛋白酶水解位點。單個分子內二硫鍵鏈接α鏈的β鏈，(αβ)2 為穩定的二硫鍵在兩個位置。人胰島素受體前體含有1382個氨基酸，其中1-27位為信號肽，加工過程中切除，28-758位加工成α亞基，763-1382位加工成β亞基，中間的759-762位的RKRR位furin蛋白酶識別切割位點，733-741位為胰島素結合位點，1361-1364位為PIK3R1結合位點，1023-1298位為胞質區激酶位點。

人胰島素受體前體從N端開始是一個富含亮氨酸的重復序列結構域(L1，殘基1-157)，一個富含半胱氨酸的區域(CR，殘基158-310)，一個富含亮氨酸的重復序列結構域(L2，殘基311-470)，3種纖連蛋白類型III結構域；FnIII-1(殘基471-595)，FnIII-2(殘基596-808) 和FnIII-3(殘基809-906)。此外，一個插入域(ID，殘基638-756)在FnIII-2結構域內，含有的α/β的弗林蛋白酶切割位位點，從該蛋白水解導致在兩者IDα和IDβ域。β鏈，FnIII -3結構域位于一個跨膜螺旋(TH)和胞內近膜(JM)區域，緊接酪氨酸激酶(TK)催化結構域，負責對隨后的細胞內信號傳導通路。

胰島素受體的α亞基完全是在細胞外，包含胰島素結合域。β亞基由細胞外結構域，跨膜結構域和胞內域組成，胞內域含有受體酪氨酸激酶，胰島素同受體的結合位點結合后，催化其受體本身磷酸化，激活下游的受體酪氨酸激酶，開始傳遞信號。