[發(fā)明專利]一種提高酶可溶性表達的融合標簽及其應用

有效

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• 申請日: 2020-12-31
• 公開（公告）號: CN112812191B
• 公開（公告）日: 2022-12-27
• 發(fā)明（設計）人: 李迅;王詢;肖龍杰;陳佳銘;王飛
• 申請（專利權）人: 南京林業(yè)大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 唐循文

一種提高酶可溶性表達的融合標簽及其應用，具有如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列中的任意一種。本發(fā)明涉及了一種普適性強的融合標簽，通過在原始酶N末端連接融合標簽可以有效提高原始酶的可溶性表達。所述的標簽序列可應用于萜類合成酶類，大幅提高酶的可溶性表達，具有很好的普適性和應用前景。

技術領域

本發(fā)明屬于分子生物學和生物化學領域，具體涉及一種提高酶可溶性表達的融合標簽(Solubility-Enhancing Tags)及其應用。

背景技術

大腸桿菌作為高效表達異源蛋白最常用的原核表達系統(tǒng)，具有結構簡單、生長速度快且易于培養(yǎng)、遺傳背景明確、便于基因操作等優(yōu)點。盡管大腸桿菌有眾多的有點，但并非每一種基因都能在其中有效表達。這歸因于每種基因都具有獨特的結構、mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率、蛋白質折疊的難易程度、宿主細胞蛋白酶對蛋白質的降解、外源基因和大腸桿菌在密碼子偏好性的差別以及蛋白質對宿主的潛在毒性等等。

獲得高表達的異源蛋白一直是科研工作者關注的重點。人們往往通過調控啟動子和核糖體位點、降低誘導溫度、添加分子伴侶、目的基因密碼子偏好性優(yōu)化等手段提高異源蛋白可溶性表達，但很多時候仍然難以奏效。近些年，使用融合標簽表達異源蛋白的技術得到廣泛使用，它的應用不僅可以應用于蛋白的分離純化，而且有的融合標簽還能促進蛋白的表達。融合標簽大多是一類能夠在大腸桿菌中大量表達、可以正確折疊且性質穩(wěn)定的一類蛋白。目前已經開發(fā)出一系列常見的融合標簽，有小分子泛素樣修飾蛋白(SUMO)、谷胱甘肽轉移酶(GST)、麥芽糖結合蛋白(MBP)、轉錄終止抗終止因子(NusA)等。但這些融合標簽不能解決所有蛋白可溶性表達的問題，這些融合標簽較大，造成較大的空間位阻，融合蛋白往往會受到融合標簽的影響失去原有活性。據此，我們設計了一類新型的小型融合標簽以及相應的表達系統(tǒng)。

發(fā)明內容

解決的技術問題：本發(fā)明為了解決異源蛋白在大腸桿菌中可溶性表達水平低的問題，提供一種提高酶可溶性表達的融合標簽及其應用。利用熒光標記的高通量篩選的方法，通過熒光強弱反映蛋白可溶性表達情況。

技術方案：一種提高酶可溶性表達的融合標簽，具有如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列中的任意一種。

上述提高酶可溶性表達的融合標簽，具有如SEQ ID NO.2-6所示核苷酸序列中的任意一種。

含有上述融合標簽的重組表達載體。

含有上述重組表達載體的重組菌。

一種提高酶可溶性表達的方法，在酶的N末端連接所述的融合標簽序列，并導入表達載體，將重組表達載體轉化至重組菌進行表達。

上述酶為萜烯合成酶。

上述萜烯合成酶為香葉醇合成酶GES、芳樟醇合成酶LaLIS、芳樟醇合成酶bLIS或檀香烯合成酶TPS。

SEQ ID NO.1任一所述核苷酸序列作為融合標簽在提高酶可溶性表達中的應用。

上述載體選用pETDuet-tac。

上述重組菌選用大腸桿菌DH5α。

有益效果：本發(fā)明涉及了一種普適性強的融合標簽，通過在原始酶N末端連接融合標簽可以有效提高原始酶的可溶性表達。所述的標簽序列可應用于萜類合成酶類，大幅提高酶的可溶性表達，具有很好的普適性和應用前景。

附圖說明

圖1是重組表達載體質粒構建過程示意圖。

圖2為實施例2～3中，融合標簽文庫構建示意圖。

圖3為實施例4中，比較不同重組大腸桿菌香葉醇產量。

圖4為實施例5中，比較普適性實驗中萜烯產量。

具體實施方式