[發明專利]一種捕獲單克隆抗體-腫瘤壞死因子融合蛋白的親和純化方法

有效

• 申請號: 202011611594.1
• 申請日: 2020-12-30
• 公開（公告）號: CN112574321B
• 公開（公告）日: 2023-10-20
• 發明（設計）人: 方國波;蔡則玲;吳珩
• 申請（專利權）人: 上海賽金生物醫藥有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C07K1/22;A61L2/18
• 代理公司: 上海一平知識產權代理有限公司 31266
• 代理人: 王正君;徐迅

本發明公開了一種捕獲抗體?腫瘤壞死因子融合蛋白的親和純化方法，具體地，本發明公開了的方法包括如下步驟：(a)提供一待純化的原料，其中所述原料含有抗體?腫瘤壞死因子融合蛋白；(b)將所述待純化的原料進行親和層析，收集含有樣品峰的洗脫液，所述親和層析的填料選自下組：Mabselecct SuRe、Prism A、Mabcapture A、Amsphere A3、Eshmuno A、KancapA 3G、Unimab 50、或其組合，所述洗脫液為含有抗體?腫瘤壞死因子融合蛋白的中間產品。用本發明方法純化的抗體?腫瘤壞死因子融合蛋白具有很高的純度和收率，并且聚集體的含量極低，因此具有很高的安全性和廣泛的應用前景。

技術領域

本發明涉及蛋白純化領域，具體地，涉及一種捕獲單克隆抗體-腫瘤壞死因子融合蛋白的親和純化方法。

背景技術

單克隆抗體廣泛應用于腫瘤的靶向治療，通過結合腫瘤組織細胞表面抗原分子，抑制腫瘤細胞的生長。為增強單克隆抗體的治療效果，對單克隆抗體進行改造，如改變糖基化修飾增加ADCC功能；單克隆抗體藕連化學分子，增加殺傷效果如ADC分子；開發雙特異性抗體結合不同的抗原分子，增強藥物功能的協調作用；開發抗體-腫瘤壞死因子融合蛋白，協調免疫細胞作用，增強抑制腫瘤細胞生長功能或殺傷。抗體-腫瘤壞死因子融合蛋白由于獨特的分子機制，目前發展成為腫瘤治療分子開發的熱點。抗體-腫瘤壞死因子融合蛋白藥物開發過程中，除關注產品的安全性和有效性外，還應重點關注分子的穩定性，特別是由于腫瘤壞死因子引起的分子聚集。

單克隆抗體制備過程中，首選Protein A層析用于單克隆抗體的捕獲。Protein A層析條件采用中性pH條件結合樣品，酸性pH條件下洗脫樣品模式。大多數單克隆抗體采用pH3.2～3.8洗脫溶液,洗脫蛋白純度較高且有高回收率。對于抗體-腫瘤壞死因子融合蛋白，由于腫瘤壞死因子融合到單克隆抗體結構中，單克隆抗體空間結構一定程度上會發生變化，同時部分融合蛋白腫瘤壞死因子如IL-10,TNFα有趨向聚集的特性，因此，采用傳統的Protein A層析條件捕獲抗體-腫瘤壞死因子融合蛋白存在一定的挑戰。

根據單克隆抗體-腫瘤壞死因子融合蛋白的特性，層析介質對單克隆抗體純化效果有較大的影響，如采用Cytiva Capto Q，Tosoh Q-600C，以樣品發生流穿的模式進行中間步驟純化，Capto Q層析介質表現為流穿模式，而Q-600C為結合模式。親和層析介質基質有親水性物質如瓊脂糖、纖維素，有疏水性物質如聚苯乙烯二乙烯苯基樹脂、聚甲基丙烯酸樹脂等，對于疏水性基質的親和層析介質，減少蛋白的非特異性吸附主要依賴于介質的制備工藝，改性程度、表面親水層穩定性及均一性。蛋白分子的特性、親和層析介質基質特性及鍵合Protein A的結構特性影響親和層析蛋白純度及收率，選擇合適的親和層析介質對抗體-腫瘤壞死因子融合蛋白純化存在一定的挑戰。

Protein A層析應用于抗體-腫瘤壞死因子融合蛋白的初步純化，主要受限于層析填料的選擇及層析條件，需要維持蛋白純度和收率之間的平衡。

因此，本領域迫切需要開發一種對在不影響收率的前提下顯著降低聚體含量的新方法。

發明內容

本發明的目的是一種對在不影響收率的前提下顯著降低聚體含量的新方法。

在本發明第一方面，提供了一種對抗體-腫瘤壞死因子融合蛋白進行純化的方法，包括步驟：

(a)提供一待純化的原料，其中所述原料含有抗體-腫瘤壞死因子融合蛋白；

(b)將所述待純化的原料進行親和層析，收集含有樣品峰的洗脫液，所述親和層析的填料選自下組：Mabselecct SuRe、Prism A、Mabcapture A、Amsphere A3、Eshmuno A、KancapA 3G、Unimab 50、或其組合，所述洗脫液為含有抗體-腫瘤壞死因子融合蛋白的中間產品。

在另一優選例中，所述抗體-腫瘤壞死因子融合蛋白包括抗Her-2人源化單克隆抗體-腫瘤壞死因子a融合蛋白。