[發明專利]基于美洲大蠊雄性附腺生殖相關基因SP28設計的siRNA及其制備方法與應用

有效

• 申請號: 202011593780.7
• 申請日: 2020-12-29
• 公開（公告）號: CN112695033B
• 公開（公告）日: 2021-08-24
• 發明（設計）人: 李昭昕;都二霞;李勝
• 申請（專利權）人: 華南師范大學;梅州市華師昆蟲發育生物學與應用技術重點實驗室廣梅園研發中心
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/70;A01N63/60;A01P7/04
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 胡輝

本發明公開了基于美洲大蠊雄性附腺生殖相關基因SP28設計的siRNA及其制備方法與應用，所述siRNA為由SEQ ID No.2所示的核苷酸序列及與SEQ ID No.2所示的核苷酸序列反向互補的核苷酸序列組成的雙鏈RNA經切割而成，將該siRNA導入美洲大蠊體內，能夠顯著抑制SP28基因的表達，進而影響雌蟲孵化率和孵化個體數，進而導致蟑螂后代數量顯著的減少，從而實現防治害蟲的最終目的，為害蟲防治提供了新的分子靶標。

技術領域

本發明屬于基因工程領域，具體涉及基于美洲大蠊雄性附腺生殖相關基因SP28設計的 siRNA及其制備方法與應用。

背景技術

美洲大蠊(蟑螂)是地球上最古老的昆蟲之一，在全球范圍內廣泛分布，是世界公認衛生害蟲。蟑螂偏愛陰暗潮濕的環境，例如廚房、廁所、倉庫、下水道、地下室等處群居。蟑螂作為一種雜食性的昆蟲，食物種類非常廣泛，包括米飯、面包、水果、甜食、熟食等等，不僅會污染食物，還會傳播疾病，是多種細菌、病毒和寄生蟲的攜帶者，給人類的生活和安全帶來了極大的危害。除此之外，蟑螂具有極強的繁殖力，一只成熟的雌蟑螂一身中可以多次產卵，每顆卵可以孵化出約16只幼蟲。由于蟑螂的這些特質，導致它成為一種最為難以防治的衛生害蟲之一。

隨著全世界對衛生害蟲的重視，市面上出現的多種多樣的蟑螂藥。這些蟑螂藥對防治蟑螂具有一定效果，但是并不能完全的控制蟑螂，一段時間內蟑螂又再次爆發，而且這些藥物往往具有一定的毒性，對生態環境具有一定的影響。隨著長期大量的使用蟑螂出現了耐藥性，意味著那些殺蟑螂藥，很難再對蟑螂起到控制作用。衛生害蟲與人們生活質量和食品一系列問題的矛盾日益凸顯。開發環境友好、高效、低毒的蟑螂防治方法是對于國家經濟發展、社會進步和食品安全具有重要意義。

發明內容

本發明旨在至少解決現有技術中存在的技術問題之一。為此，本發明提出一種基于美洲大蠊雄性附腺生殖相關基因SP28設計的siRNA，能夠特異沉默基因SP28導致雌蟲的生殖力和孵化率顯著降低。

本發明還提出上述siRNA的制備方法。

本發明還提出提供編碼上述siRNA的基因及含有該編碼基因的表達載體、轉基因細胞系或宿主菌。

本發明還提出上述siRNA的應用。

根據本發明的第一方面實施方式的基于美洲大蠊雄性附腺生殖相關的SP28基因設計的 siRNA，所述siRNA為由SEQ ID No.2所示的核苷酸序列及與SEQ ID No.2所示的核苷酸序列反向互補的核苷酸序列組成的雙鏈RNA經切割而成。

根據本發明的一些實施方式，所述切割采用內切酶。

根據本發明的第二方面實施方式的上述siRNA的制備方法，包括以下步驟：

S1、根據美洲大蠊SP28基因序列設計dsRNA靶向序列；

S2、根據dsRNA靶向序列設計引物，通過PCR擴增克隆至質粒載體中；

S3、基于重組質粒載體設計兩端含有T7啟動子的引物，進行PCR擴增；

S4、將步驟S3得到的PCR產物轉錄合成得到dsRNA；

S5、將合成的dsRNA切割成siRNA。

根據本發明的一些實施方式，步驟S2所述載體選自p18T載體。

根據本發明的一些實施方式，步驟S4所述轉錄合成采用T7RiboMAX Express RNAiSystem。

根據本發明的一些實施方式，步驟S5所述的切割dsRNA采用試劑盒RNaseIII。

根據本發明的一些實施方式，步驟S5所述切割而成的siRNA的分子量約為21nt。