[發(fā)明專利]DHFR基因內(nèi)含子19bp插入突變的檢測方法、試劑盒及試劑盒的使用方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011591459.5
• 申請日: 2020-12-29
• 公開（公告）號: CN114686581A
• 公開（公告）日: 2022-07-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉健喆;任玉冰;張娟;何勝寬;蔡傳良;郭東東
• 申請（專利權(quán)）人: 深圳泰樂德醫(yī)療有限公司
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12Q1/6851
• 代理公司: 廣東恩典律師事務(wù)所 44549
• 代理人: 張紹波

本發(fā)明提供一種DHFR基因內(nèi)含子19bp插入突變的檢測方法，依據(jù)DHFR基因內(nèi)含子19bp設(shè)計PCR引物組合以及特異檢測熒光探針，對待測樣品進(jìn)行實時熒光定量PCR，從而對DHFR基因內(nèi)含子19bp插入突變的類型進(jìn)行分型。本發(fā)明還提出所述PCR引物組合以及特異檢測熒光探針在制備用于檢測DHFR基因內(nèi)含子19bp插入突變中的應(yīng)用。本發(fā)明還提出用于檢測DHFR基因內(nèi)含子19bp插入突變的試劑盒。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及插入突變檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種DHFR基因內(nèi)含子19bp插入突變的檢測方法及試劑盒的的使用方法。

背景技術(shù)

基因組DNA在某一特定的核苷酸序列上發(fā)生轉(zhuǎn)換，顛倒，插入或缺失，并且在群體中出現(xiàn)頻率≥1%，稱為基因多態(tài)性。基因多態(tài)性可能與某些生理代謝功能，藥物敏感性有關(guān)，分子水平的診斷可以給予患者疾病預(yù)防，個體化治療，預(yù)后判斷等指導(dǎo)。

人體內(nèi)的二氫葉酸還原酶（DHFR）利用NADPH還原二氫葉酸產(chǎn)生四氫葉酸，是葉酸代謝過程中的關(guān)鍵酶。研究發(fā)現(xiàn)在DHFR內(nèi)含子區(qū)域19bp缺失可以導(dǎo)致多種疾病如脊柱裂，白血病，自閉癥的比值比（OR）顯著性提高。其原理可能是由于該位點(diǎn)的缺失導(dǎo)致基因表達(dá)量下調(diào)，從而影響了DHFR的合成量，進(jìn)一步影響生理代謝。

DHFR 19bp插入突變檢測，有助于臨床醫(yī)生制定相應(yīng)的心腦血管疾病預(yù)防，治療方案。使得高風(fēng)險人群能夠通過一級預(yù)防措施降低患病風(fēng)險，使心腦血管疾病患者得到更加具有針對性的治療。該突變位點(diǎn)可用于心腦血管疾病診斷，高危人群的患病危險度評估，也可用于葉酸，維生素D等相關(guān)營養(yǎng)元素補(bǔ)充劑用法的指導(dǎo)。甚至可以將其與葉酸代謝途徑中其他關(guān)鍵基因的SNP位點(diǎn)聯(lián)合診斷，再通過恰當(dāng)?shù)哪Ｐ徒o患者一個更精準(zhǔn)的治療方案。

長時間以來，DHFR多態(tài)性基因型分析大多采用sanger測序法，或PCR-PFLP檢測技術(shù)，由于PCR-PFLP技術(shù)依賴于限制性核酸內(nèi)切酶消化以及電泳分析，往往會產(chǎn)生一些結(jié)果的誤判。Sanger測序法則測序周期長，通量較低，需要昂貴的設(shè)備和復(fù)雜的操作，也不適用于大規(guī)模篩查或快速給出診斷結(jié)果，難以大規(guī)模推廣。

發(fā)明內(nèi)容

為解決上述問題，本申請?zhí)峁┮环NDHFR基因內(nèi)含子19bp插入突變的檢測方法，所述方法能夠同時檢測DHFR基因的野生型、純合突變型和雜合型中的任意一種依據(jù)DHFR基因內(nèi)含子19bp插入突變區(qū)域設(shè)計PCR引物組合和特異檢測熒光探針，對樣本進(jìn)行實時熒光定量PCR，進(jìn)而鑒定DHFR基因的野生型，純合突變型和雜合型中任意一種或幾種的組合。

PCR引物組合：

正向引物DHFR-F：5’-CAAAGACCTCACCGGGCA-3’；

反向引物DHFR-R：5’-CCAAACGGGCGCAGGC -3’；

特異檢測熒光探針：

探針1：熒光基團(tuán)5’-TCGCGCGTCCCGCCCAGGT-3’淬滅基團(tuán)；

探針2：熒光基團(tuán)5’-AGTCGGCCACCCCGACCGT-3’淬滅基團(tuán)。

需要說明的是，引物起到給PCR反應(yīng)一個起點(diǎn)的作用，在PCR反應(yīng)的退火步驟中引物以堿基互補(bǔ)配對原則結(jié)合到DNA模板上，并通過Taq酶從5’端向3’端進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對的延伸反應(yīng)，使在變性步驟中氫鍵斷裂變?yōu)閱捂湹腄NA模板重新形成完整的雙鏈結(jié)構(gòu)，并由1個DNA分子變?yōu)?個DNA分子。

還需要說明的是，本發(fā)明中所述的引物是指由一定數(shù)量的dNTP構(gòu)成的寡核苷酸鏈，由DNA合成儀進(jìn)行人工合成得到，引物可與待擴(kuò)增目的核酸鏈上與之互補(bǔ)的區(qū)域結(jié)合，作為PCR反應(yīng)的起點(diǎn)進(jìn)行DNA鏈的延伸反應(yīng)。