[發明專利]呈遞SARS-COV-2的RBM不同區域肽表位的病毒樣顆粒疫苗構建方法

有效

• 申請號: 202011586020.3
• 申請日: 2020-12-29
• 公開（公告）號: CN113150082B
• 公開（公告）日: 2022-11-08
• 發明（設計）人: 馬雁冰;龍瓊;楊英;黃惟巍;白紅妹;孫文佳;楊旭;李多
• 申請（專利權）人: 中國醫學科學院醫學生物學研究所
• 主分類號: C07K14/02
• 分類號: C07K14/02;C12N15/50;C12N15/86;C12N15/66;A61K39/215;A61P31/14
• 代理公司: 昆明正原專利商標代理有限公司 53100
• 代理人: 徐玲菊;于洪

本發明涉及一種呈遞SARS?COV?2的RBM不同區域肽表位的病毒樣顆粒疫苗構建方法，包括以下步驟：在SARS?COV?2的RBM中篩選不同的肽表位，將該基因插入到乙肝病毒核心抗原HBcAg的78?79位氨基酸之間，得到重組質粒pHBcAg?P2、pHBcAg?P3、pHBcAg?P4、pHBcAg?P6，將該質粒轉化大腸桿菌DH5α或BL21感受態細胞上，用IPTG誘導、純化，得到呈遞P2，P3，P4，P6的病毒樣顆粒疫苗。只需幾次免疫注射該疫苗即可誘導強的針對自身分子的、有持續作用的中和性抗體，以中和新型冠狀病毒的感染，為新型冠狀病毒疫苗研發提供新思路并奠定堅實基礎。

技術領域

本發明屬于分子生物學及免疫學技術領域，具體涉及一種呈遞SARS-COV- 2的RBM不同區域肽表位的病毒樣顆粒疫苗構建方法。

背景技術

SARS-CoV-2是引起肺炎病例的病原體，其引起的癥狀類似于嚴重急性呼 吸綜合征冠狀病毒(SARS-CoV)感染，在2020年3月11日被世界衛生組織(世 衛組織)宣布為大流行之后，迫切需要了解和開發針對SARS-CoV-2的有效治療 干預措施。

SARS-CoV-2與SARS-CoV密切相關，2002-2004年SARS爆發后，針對 SARS-Cov的疫苗在臨床前被開發出來，其中兩種疫苗在一期試驗中進行了試 驗。然而，由于該病毒已從人類中根除，并且自2004年以來沒有再出現，因此 發展停止了。目前正在積極開發針對MERS-CoV的疫苗，并得到了流行病防備 創新聯盟(CEPI)的支持。

通過對SARS-CoV和MERS-CoV疫苗的臨床前研究，冠狀病毒疫苗的抗原 靶點已經明確。大多數冠狀病毒只編碼一種大的表面蛋白，即刺突蛋白，它負 責受體結合和膜融合。在SARS-CoV-2(和SARS-CoV)的病例中，刺突蛋白與宿 主細胞上的血管緊張素轉換酶2(ACE2)結合，因此，阻斷與ACE2的結合，或 阻斷宿主蛋白酶裂解S糖蛋白釋放融合肽是防止冠狀病毒侵入的有效策略。基 于這一知識，以及從SARS-CoV和MERS-CoV的臨床前研究中獲得的信息，S 蛋白被確定為一個抗原靶點，用于在非常早期階段開發針對SARS-CoV-2的疫苗。

SARS-CoV-2的S蛋白被水解為S1和S2兩個亞基，其中S1亞基包含受 體結合區域(RBD)，RBM是存在于S1的受體結合域(RBD)上的受體結合基 序(RBM)。據了解，阻斷RBD和ACE2關聯部位的受體結合基序(RBM)是SA RS-CoV中和的主要機制。

明確主要的抗原靶點后，抗原呈遞方式是影響疫苗效果的關鍵因素。現有 常規技術手段主要是與異源蛋白連接或者加強佐劑，我們在SARS-CoV-2的R BM區域中篩選出具有中和新型冠狀病毒潛力的肽表位，但其免疫原性較低，產 生的抗體滴度不高。

目前提高抗原免疫原性常用的方法是用強的佐劑，例如弗氏佐劑，或者增 加抗原免疫劑量，但是這些常規的方法常常帶來很大的副作用，例如弗氏佐劑 含有甘油、羊毛脂、死的結核分枝桿菌等，免疫后表現為局部潰爛，瘙癢，膿 腫等，而機體也會引起強烈的免疫應答；過多劑量的抗原會導致免疫系統產生 免疫耐受，需要尋找更理想的抗原遞呈方式。因此如何克服現有技術的不足是 目前分子生物學及免疫學技術領域亟需解決的問題。

發明內容

本發明要解決的技術問題在于，針對現有常規手段不能增強SARS-CoV-2 天然S蛋白結構中免疫原性較低的表位，篩選RBM中9個肽表位與KLH載體 偶聯后免疫動物，誘導產生的抗體進行體外中和實驗，并選擇其中4個肽表位， 構建了一種有效的呈遞RBM肽表位的病毒樣顆粒疫苗(選擇了4個肽表位，構 建了4個呈遞肽表位的病毒樣顆粒疫苗)，只需要幾次疫苗注射即可產生針對表 位的較強的中和性抗體，從而達到阻止新型冠狀病毒感染的目的。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案如下：

呈遞SARS-COV-2的RBM不同區域肽表位的病毒樣顆粒疫苗構建方法， 包括以下步驟：