[發明專利]一種GPHB5/GPHA2重組蛋白及其表達載體、制備方法和應用

在審

• 申請號: 202011585506.5
• 申請日: 2020-12-28
• 公開（公告）號: CN112759655A
• 公開（公告）日: 2021-05-07
• 發明（設計）人: 李芳紅;千愛君;趙子建;趙正剛;蕭耿苗;鄧木蘭
• 申請（專利權）人: 廣東工業大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/70;C12N15/66;C12N15/65;C12N15/85;C12N1/21;A61K38/22;A61P3/04;C12R1/19
• 代理公司: 廣州幫專高智知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 44674
• 代理人: 顏德昊

本發明公開了一種GPHB5/GPHA2重組蛋白及其表達載體、制備方法和應用，屬于基因工程技術領域。表達所述GPHB5/GPHA2重組蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.2所示。本發明將在真核表達系統中易于表達的GPHB5和GPHA2的基因片段進行人源密碼子優化，使得GPHB5/GPHA2重組蛋白在Expi293F細胞中大規模表達。本發明所提供的GPHB5/GPHA2重組蛋白可作為多肽類減肥藥應用。

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，具體涉及一種人源GPHB5/GPHA2重組蛋白及其表達載體、制備方法和應用。

背景技術

人促甲狀腺激素(TSH)、促卵泡激素(FSH)、促腎上腺皮質激素(LH)和絨毛膜促性腺激素(CG)是糖蛋白激素家族的成員，該家族衍生自常見的α亞基與激素特異性β亞基的異源二聚化作用。2002年發現了兩個新的人類糖蛋白激素樣基因：α2(A2)和β5(B5)，基于兩個新的糖蛋白激素亞基的二聚化，我們進行了一系列的研究。

發明內容

本發明提供一種GPHB5/GPHA2重組蛋白，表達該GPHB5/GPHA2重組蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.2所示。將在真核表達系統中易于表達GPHB5和GPHA2的基因片段進行人源密碼子優化，使得GPHB5/GPHA2重組蛋白在高產量蛋白表達系統(如；Expi293F細胞)中可大規模表達。

本發明還提供了一種含有表達GPHB5/GPHA2重組蛋白的基因的表達載體，在含有抗博萊霉素的抗性選擇基因的表達載體中包含有SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2核苷酸序列，表達載體優選pBudCE4.1載體，載體序列如SEQ ID NO.3所示。

本發明還提供了表達如上述重組載體的宿主菌。所述宿主菌為具有博萊霉素抗性的表達菌株，優選大腸桿菌E.coli MJ109。

本發明中表達GPHB5/GPHA2重組蛋白的載體的制備方法，合成表達GPHB5和GPHA2的全基因片段，并對pBudCE4.1載體進行如下處理：GPHB5基因克隆至限制性內切酶HindIII和BamH I酶切位點之間，GPHA2基因克隆至載體的Not I/Xho I位點之間，獲得pBudCE4.1-GPHB5/GPHA2重組質粒。本發明中表達GPHB5和GPHA2的全基因片段由南京金斯瑞公司合成。

將pBudCE4.1-GPHB5/GPHA2質粒轉化至MJ109大腸桿菌中，挑取單克隆進行質粒酶切鑒定以及DNA測序方法驗證插入序列的正確性。將測序正確的重組質粒pBudCE4.1-GPHB5/GPHA2為模板加入到哺乳動物Expi293F細胞中，即可誘導表達GPHB5/GPHA2重組蛋白。

因此，本發明的GPHB5/GPHA2重組蛋白的制備方法，包括如下步驟：

步驟1，利用HindIII/BamHI雙酶切位點將SEQ ID NO:1所示序列插入至表達載體pBudCE4.1中，獲得C端含有His標簽的重組質粒；利用NotI/Xho I雙酶切位點將SEQ ID NO:2所示序列插入至表達載體pBudCE4.1中，獲得C端含有His標簽的重組質粒；

步驟2，將pBudCE4.1-GPHB5/GPHA2重組質粒為模板轉染至HEK293T細胞或Expi293F細胞中進行表達，誘導表達GPHB5/GPHA2重組蛋白。

在上述步驟1之后，還包括將pBudCE4.1-GPHB5/GPHA2重組質粒轉化至MJ109大腸桿菌中，挑取單克隆進行質粒酶切鑒定以及DNA測序方法驗證插入序列的正確性。